染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白7表達(dá)與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

陳 穎,鄧周峰,江衛(wèi)華,周 嘉,蘇明琪,韓 駿,張 輝*

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院 腫瘤科，上海200336；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院 肝膽外科，上海200336；3.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽醫(yī)院 肝外三科，上海200438)

染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白7表達(dá)與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

陳 穎1,鄧周峰1,江衛(wèi)華1,周 嘉2,蘇明琪2,韓 駿3,張 輝2*

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院 腫瘤科，上海200336；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院 肝膽外科，上海200336；3.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽醫(yī)院 肝外三科，上海200438)

目的 通過(guò)研究肝癌組織內(nèi)染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白7(CHD7)的表達(dá)及其與肝癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，探討CHD7作為肝癌預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)的可行性。方法 將286例肝切除術(shù)后病理確診為肝細(xì)胞肝癌的標(biāo)本制作成組織芯片。采用免疫組化法檢測(cè)肝癌及癌旁肝組織中CHD7的表達(dá)水平，分析其與肝癌患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示CHD7在肝癌組織中表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織。CHD7高表達(dá)與腫瘤數(shù)目、腫瘤包膜完整性、腫瘤血管侵犯、TNM分期及BCLC分期密切相關(guān)，與肝癌患者術(shù)后總體生存率呈負(fù)相關(guān)，而與肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)。結(jié)論 CHD7在肝癌中明顯高表達(dá)，可作為肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)之一。

肝細(xì)胞肝癌 (HCC)；染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白7(CHD7)；預(yù)后；組織芯片

(ChinJLabDiagn,2017,21:0761)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是致死率最高的惡性腫瘤之一[1]。隨著圍手術(shù)期處理方法、外科切除、肝移植以及部分輔助療法的成熟，肝癌五年生存率有了一定程度的提高[2]。但是，肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)，肝內(nèi)、肝外轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)仍較大[3,4]。因此，全面了解肝癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制，尋找對(duì)預(yù)后和治療有指導(dǎo)意義的分子標(biāo)記非常重要。

染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白7(CHD7)是染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白家族中的一種，為ATP依賴型的染色質(zhì)重塑體，其生物學(xué)功能多與人先天性畸形相關(guān)，并且在小細(xì)胞肺癌、胰腺癌等多種腫瘤中異常表達(dá)和活化，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲等功能[5-7]。本研究通過(guò)組織芯片行免疫組化明確286例行根治性切除術(shù)的肝細(xì)胞癌患者腫瘤相關(guān)組織中CHD7的表達(dá)情況，分析CDH7與肝癌患者臨床特征及預(yù)后之間的關(guān)系，探討CHD7在肝癌中的表達(dá)差異及作為肝癌預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)的可行性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2006-2011年在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院就診的行肝癌根治性切除患者286例，所有患者均經(jīng)病理診斷確診為肝細(xì)胞肝癌，每位患者的組織標(biāo)本取癌與癌旁各2個(gè)點(diǎn)。所有患者術(shù)后均復(fù)查甲胎蛋白(alpha -fetal protein，AFP)、B超(3年內(nèi)每3個(gè)月一次，3年以后每半年一次)，磁共振(每年一次)，以監(jiān)測(cè)腫瘤有無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。如果出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移則根據(jù)患者一般情況、腫瘤的大小、位置及肝外轉(zhuǎn)移情況評(píng)估后行再次手術(shù)或介入、放射、射頻消融等治療。所有患者隨訪時(shí)間至2016年6月，標(biāo)本收集經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色(IHC)

免疫組化試劑盒購(gòu)自基因科技(上海)有限公司。組織芯片由上海芯超生物科技有限公司制作，常規(guī)烘烤切片，依次經(jīng)二甲苯、酒精處理脫蠟后PBS清洗、經(jīng)H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶及檸檬酸修復(fù)抗原處理，加CHD7抗體(美國(guó)Abcam 公司，1∶200稀釋)4℃度孵育過(guò)夜，二抗37℃孵育0.5 h，PBST清洗后DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染、封片。

1.3 免疫組化結(jié)果判讀

由兩位病理科醫(yī)師雙盲方式獨(dú)立評(píng)分，棕黃色顆粒狀沉積物為陽(yáng)性。按陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)百分比分4級(jí)：無(wú)陽(yáng)性染色細(xì)胞為0分，≤34%陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為1分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在34%-66%之間為2分，≥66%以上陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為3分。按照染色強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)分別為：無(wú)染色為0分,弱陽(yáng)性1分，中度陽(yáng)性2分，強(qiáng)陽(yáng)性3分。綜合陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分(兩項(xiàng)相乘)，0-6分為CHD7低表達(dá)(CHD7 low)，>6分為CHD7高表達(dá)(CHD7 high)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 17.0(SPSS，Chicago，IL)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。CHD7表達(dá)情況與其他臨床病理特征之間關(guān)系用Pearson卡方檢驗(yàn)驗(yàn)證。繪制總生存和復(fù)發(fā)的Kaplan-Meier生存曲線，并對(duì)其進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)。用單因素和多因素分析研究各因素對(duì)預(yù)后的影響。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHD7在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

為了解CHD7在肝癌組織中的表達(dá)情況，對(duì)286例根治性肝細(xì)胞癌切除術(shù)后患者癌及癌旁肝組織制成的組織芯片行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示CHD7蛋白定位于腫瘤及正常肝組織的細(xì)胞核內(nèi)，CHD7在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁正常肝臟組織(63%vs12%，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 CHD7在肝癌組織及癌旁組織中的免疫組化染色結(jié)果(×100)

2.2 CHD7在肝癌組織中表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

在286例患者中，肝癌組織中CHD7表達(dá)與腫瘤數(shù)目(P=0.004)、腫瘤包膜完整性(P=0.012)、腫瘤血管侵犯(P=0.026)、TNM分期(P=0.03)及BCLC分期(P=0.04)密切相關(guān)，而與患者的性別(P=0.21)、年齡(P=0.797)、AFP(P=0.467)、肝硬化(P=0.399)及腫瘤大小(P=0.906)均無(wú)關(guān)。CHD7蛋白在肝癌的表達(dá)情況及與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系見(jiàn)表1。

2.3 CHD7在肝癌組織中表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性

應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線研究CHD7表達(dá)與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性，286例患者均獲得隨訪資料，Kaplan-Meier生存權(quán)限分析顯示CHD7 high(n=180)組的總生存率明顯低于CHD7 low組(n=106)(P=0.0347),而肝癌腫瘤的復(fù)發(fā)率CHD7 high組(n=180)則高于CHD7low組(n=106)(P=0.0291)，見(jiàn)圖2。

表1 CHD7的表達(dá)與肝癌臨床病理因素之間的關(guān)系

#χ2test

COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素分析結(jié)果顯示：CHD7表達(dá)(P=0.038)、腫瘤血管侵犯(P<0.001)、AFP(P<0.001)、腫瘤大小(P<0.001)及腫瘤數(shù)目(P<0.001)是HCC患者總生存的不良因素，而CHD7表達(dá)(P=0.032)、腫瘤血管侵犯(P<0.001)、AFP(P=0.001)、腫瘤大小(P<0.001)及腫瘤數(shù)目(P<0.001)是HCC患者腫瘤復(fù)發(fā)的不良因素。COX逐步回歸的多因素分析結(jié)果表明CHD7高表達(dá)可以作為預(yù)測(cè)HCC患者不良預(yù)后的獨(dú)立因素，見(jiàn)表2,3。

3 討論

外科手術(shù)切除是肝細(xì)胞癌治療的首選及最主要的治療手段[8]。隨著外科手術(shù)技術(shù)的發(fā)展與成熟，肝癌的切除率逐漸提高。但由于長(zhǎng)期受到環(huán)境與基因交互作用，肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率仍然較高，多數(shù)患者預(yù)后較差[9-11]。篩查術(shù)后高危復(fù)發(fā)人群并及時(shí)干預(yù)，是降低復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率，提高肝癌手術(shù)切除療效的關(guān)鍵。雖然目前研究已揭示了部分肝細(xì)胞癌相關(guān)的原癌基因與抑癌基因，但對(duì)于其復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制與通路仍了解有限[12,13]。因此，探究可以有效鑒定復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的分子標(biāo)記來(lái)預(yù)測(cè)患者的生存風(fēng)險(xiǎn)并指導(dǎo)治療方案十分必要。

圖2 CHD7在癌組織中高低表達(dá)的總體生存率和復(fù)發(fā)率

表2 患者總生存期的單因素分析和多因素分析

*HR:hazard ratio

表3 患者腫瘤復(fù)發(fā)的單因素分析和多因素分析

*HR:hazard ratio

染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白家族屬于ATP依賴的染色質(zhì)重組SNF2超家族，由9個(gè)蛋白組成(CHD1-CHD9)。該家族蛋白以N端相同的染色質(zhì)串聯(lián)域以及ATP依賴的解螺旋酶區(qū)域?yàn)樘攸c(diǎn)。N端染色質(zhì)域可識(shí)別并結(jié)合核小體，介導(dǎo)染色質(zhì)相互作用。而ATP依賴的解螺旋酶區(qū)域參與轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重結(jié)合、DNA修復(fù)等細(xì)胞核生物學(xué)功能。因此CHD家族蛋白廣泛參與正常的細(xì)胞、組織發(fā)展過(guò)程，其突變與多種疾病密切相關(guān)[14-17]。CHD7具體的功能目前仍處于研究狀態(tài)，多與染色質(zhì)重塑相關(guān)。在目前的研究中，突變的CHD7可引起嚴(yán)重的多系統(tǒng)器官異常的CHARGE綜合征，致死率較高[7,15]。CHD7在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也起到重要作用。Pleasance等[5]研究發(fā)現(xiàn)，CHD7在非小細(xì)胞型肺癌中重排列，與細(xì)胞損傷修復(fù)異常相關(guān)，對(duì)肺癌的進(jìn)展有一定促進(jìn)作用。在Lauren E.Colbert等[6]的研究中，降低CHD7的表達(dá)可提高胰腺癌病人術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存率與總體生存率，并可作為胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后評(píng)價(jià)的分子標(biāo)記。綜上說(shuō)明，CHD7對(duì)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移起到重要的促進(jìn)作用。目前我們的研究發(fā)現(xiàn)CHD7在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁非癌組織，肝癌組織中CHD7表達(dá)與腫瘤數(shù)目、腫瘤包膜完整性、腫瘤血管侵犯、TNM分期及BCLC分期密切相關(guān)。與此同時(shí)，通過(guò)Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)CHD7高表達(dá)的HCC患者預(yù)后明顯較差，而低表達(dá)的HCC患者預(yù)后相對(duì)較好，提示CHD7與HCC患者預(yù)后緊密相關(guān)，進(jìn)一步的COX逐步回歸的多因素分析證明了CHD7是預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后的獨(dú)立因素之一，因此我們推測(cè)CHD7可以作為預(yù)測(cè)HCC患者獨(dú)立預(yù)后的分子標(biāo)記。

總之，CHD7在肝癌組織中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤的不良臨床病理特征密切相關(guān)；CHD7的高表達(dá)是肝癌根治性切除術(shù)后的總體生存率和無(wú)瘤生存率的獨(dú)立預(yù)后因素之一，可以作為肝癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。通過(guò)對(duì)肝癌組織中CHD7的檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)高危復(fù)發(fā)患者，有助于實(shí)現(xiàn)肝癌的個(gè)體化治療，可有效降低復(fù)發(fā)率，提高長(zhǎng)期生存時(shí)間。

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Correlation of chromodomain helicase DNA binding protein 7 expression with clinical and pathological characteristics and prognosis of hepatocellular carcinoma

CHENYing,DENGZhou-feng,JIANGWei-hua,etal.

(DepartmentofOncology,TongrenHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200336,China)

Objective To explore the clinical significance of chromodomain helicase DNA binding protein 7(CHD7) expression in hepatocellular carcinoma(HCC)and association between CHD7 expression and survival in HCC patients．Methods With the use of immunoreactivity,CHD7 expression and its correlation with other clinicopathological characteristics were examined in a tissue microarray that contains samples from 286 HCC patients．Results HCC tissues expressed markedly higher levels of CHD7 than did adjacent non-tumor tissues,overexpression of CHD7 significantly correlates with tumor number，capsular formation，microvascular invasion,TNM Stage,BCLC Stage and shorter overall survival with higher recurrence rates in HCC patients after curative resection．Conclusion The expression levels of CHD7 in HCC are significantly higher，may be an independent prognostic factor for HCC patients．

hepatocellular carcinoma;chromodomain helicase DNA binding protein 7;prognostic;Tissue chip

上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)面上項(xiàng)目(201640275)

*通訊作者

1007-4287(2017)05-0761-05

R735.7

A

陳穎，36歲，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：消化道腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究。

2017-01-17)