低溫保存對圍生期間充質干細胞生物學特性的影響

安媛+++張錚++杜彬++楊云霜++付曉菲+++馮博++任召祺+++楊超

[摘要] 目的 探討低溫保存對圍生期間充質干細胞（P-MSCs）體外培養的生物學特性的影響。 方法 從臍帶組織分離、培養P-MSCs，取第3代細胞梯度降溫凍存后于液氮深低溫保存6個月后復蘇。比較低溫保存前后PMSCs的增殖活性、細胞衰老情況、細胞表面標志物及向脂肪和成骨方向分化的潛能。未經低溫保存的第3代P-MSCs作為對照。 結果 低溫保存的P-MSCs增殖活性、衰老率與未凍存細胞相比差異無統計學意義（P > 0.05）。低溫保存的P-MSCs表達間充質干細胞的表面標志CD44、CD90和CD105，且能夠向成骨和脂肪細胞分化。 結論 低溫保存復蘇后間充質干細胞仍保持良好的體外生長特性和多向分化的潛能。

[關鍵詞] 圍生期間充質干細胞；低溫保存；生物學特性

[中圖分類號] R394.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（c）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of cryopreservation on biological features of perinatal mesenchymal stem cells （P-MSCs）. Methods P-MSCs were isolated from human umbilical cord and subcultured in vitro. The third-generation P-MSCs were frozen with a controlled rate freezer and thawed 6 months after liquid nitrogen storage. The effect of cryopreservation on P-MSCs viability， senescence-associated β-gal activity， cell surface markers and adipogenic and osteogenic differentiation property were evaluated. The third-generation P-MSCs without storage were taken as control. Results After cryopreservation， P-MSCs remained maintained a growth rate similar to the P-MSCs without storage， also had the similar senescence-associated β-gal activity （P > 0.05）. The P-MSCs after cryopreservation also highly expressed CD44， CD90 and CD105， and had the adipogenic and osteogeic differentiation potential. Conclusion P-MSCs maintain their biological characteristics and have the differentiation potential after cryopreservation and thawing.

[Key words] Mesenchymal stem cells； Cryopreservation； Biological features

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一群具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的成體干細胞[1]。MSCs在特定的誘導條件下能夠分化形成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等，也可橫向分化成多種胚層來源的細胞，如胃腸道上皮細胞、肝細胞、表皮細胞、肺泡、胰腺和神經細胞等[2-6]。此外，MSCs對造血恢復、免疫炎癥反應和血管發生等發揮著重要的調節作用[7-9]。MSCs除具有以上的生物學特性外，還易于外源基因的感染和表達，且攜帶的外源基因表達具有明顯的組織特異[10]。圍生期間充質干細胞（perinatal mesenchymal stem cells，P-MSCs）是從人臍帶、胎盤和臍帶血等圍生期組織獲得的間充質干細胞，取材方便，在組織工程學、細胞治療等領域顯示出非常巨大的研究和應用前景[11-12]。研究顯示，P-MSCs已經應用于神經系統疾病、心血管疾病、糖尿病及自身免疫性疾病的臨床試驗，具有十分廣闊的應用前景[13-15]。

細胞的制備技術具有多樣性和復雜性，國家藥監局相繼出臺了一系列干細胞應用的指導原則[16]，規范了干細胞臨床研究和應用行為，以確保干細胞治療的安全性和有效性。目前，長期保存干細胞的方法通常是建立干細胞庫，低溫保存，以滿足在需要時進行擇期細胞移植。低溫保存效果的優劣直接影響著P-MSCs的數量和質量。因此，低溫保存后的P-MSCs是否能夠存活并保持其生物學特性是其臨床應用的重要因素。

1 材料與方法

1.1 材料

圍生期組織由火箭軍總醫院婦產科提供，征得產婦本人的知情同意，經過火箭軍總醫院倫理委員會批準同意。產婦28歲，孕39周+2，乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒學檢測均陰性。ɑ-MEM、特級胎牛血清均購自Gbico公司；細胞培養板/皿購自Corning公司；膠原酶、胰蛋白酶、堿性磷酸酶試劑盒和化學試劑均購自Sigma公司；細胞衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；CD44、CD90和CD105抗體購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 P-MSCs的分離、培養 無菌條件下，將新鮮的臍帶組織置于含有雙抗的無菌生理鹽水中浸泡30 min，用組織鑷剝離華通氏膠和臍帶動靜脈，漂洗后用手術剪刀將臍帶剪成1 cm3的小塊，置于離心管中加入適量的Ⅰ、Ⅳ混合型膠原酶，置于37℃的孵箱中消化30～40 min后，終止消化，3000 r/min離心20 min，棄上清，用完全培養基（90% ɑ-MEM+10%特級胎牛血清）重懸細胞，接種于75 cm2培養瓶，置于37℃、5%CO2孵箱中培養。72 h后細胞換液，此后每1～2天換液1次。