黃曲霉毒素檢測系統的設計與實現*

陸勤佳,蔡 強*,沈國金,王振華

(1.杭州電子科技大學電子信息學院,杭州 310018;2.浙江清華長三角研究院,浙江 嘉興 314006)

黃曲霉毒素檢測系統的設計與實現*

陸勤佳1,2,蔡 強1,2*,沈國金2,王振華2

(1.杭州電子科技大學電子信息學院,杭州 310018;2.浙江清華長三角研究院,浙江 嘉興 314006)

基于高效液相色譜熒光法設計并完成了一套黃曲霉毒素檢測系統。該系統主要由分離系統、恒溫控制系統、熒光檢測器、主控板和人機交互界面組成。儀器通過分離系統將黃曲霉毒素進行分離,再由熒光檢測器激發黃曲霉毒素產生熒光,以光子計數的方式進行信號采集,最終在PC的色譜工作站上顯示檢測結果。經測試表明該系統具有良好的穩定性,結構緊湊,檢測速度快,靈敏度高,能用于黃曲霉毒素的實際檢測。

高效液相色譜熒光法;黃曲霉毒素檢測;熒光檢測器;光子計數

黃曲霉毒素AFT(Aflatoxin)是由真菌類如黃曲霉菌、寄生曲霉菌產生的一類有毒的次級代謝產物,主要包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2[1]。它們在自然界中廣泛存在,且具有強致癌性[2-3]。黃曲霉毒素已成為食品質檢的必檢項目之一[4]。

黃曲霉毒素的檢測方法有薄層色譜法、高效液相色譜法[5-6]、也有一些酶聯免疫吸附法[7]、檢測卡等快檢方法。國標檢測法靈敏度高、重現性好,可同時檢測多個黃曲霉種類。但是檢測周期長,操作復雜,且一般檢測儀器龐大,不能滿足簡捷、現場化的要求。而免疫檢測法雖然檢測速度快、操作簡單,但是檢測準確度和精確度都比較差。

本文以高效液相色譜法為基礎,開發特定波長熒光檢測模塊,將液相色譜和熒光檢測集成于儀器,研制專用黃曲霉毒素檢測系統,力圖解決傳統國標檢測儀器體積龐大、操作復雜的問題。

1 系統結構和檢測原理

圖1和圖2分別為黃曲霉毒素檢測系統的結構圖和實物圖。該系統主要由分離系統、恒溫控制系統、熒光檢測器、主控板和人機交互界面組成。

檢測原理:儀器上電后輸液泵工作加壓,待測AFT樣品(經提取、凈化處理后所得樣品)通過進樣閥加入,隨流動相進入柱溫箱內的C18色譜柱中[8]。各AFT在親和色譜作用下被分離,依次進入檢測器內置的玻盒中。在LED的激發下各AFT產生光強不等的熒光信號。這些熒光信號經過透鏡、濾光片等光路作用被PMT接收,由計數模塊進行光子計數[9]并上傳給上位機,最終上位機通過譜圖處理得到各AFT的濃度。

圖1 黃曲霉毒素檢測系統結構圖

圖2 黃曲霉毒素檢測系統實物圖

2 主要硬件模塊

2.1 分離系統

分離系統主要由輸液泵和C18色譜柱組成。其中輸液泵采用清博華科技的一款型號為P1010的產品。色譜柱采用了賽智的一款型號為Vertex-C18色譜柱。

2.2 恒溫控制系統

溫度會影響C18色譜柱對AFT的分離效果。為了保證檢測結果的準確性,設計了恒溫控制系統,將色譜柱溫度控制在25°C(±1°C)。圖3為恒溫控制系統實物圖。它由柱溫箱、制冷熱片、風扇、DS18B20溫度傳感器以及溫控板組成。柱溫箱為一個柱狀封閉的鋁合金箱體,用于放置C18色譜柱。在柱溫箱(距兩側20 cm)下壁緊貼著兩個半導體制冷熱片,制冷熱片的下方是兩個用于輔助散熱的風扇。在箱體的兩側裝有兩個防水型DS18B20數字溫度傳感器[10],用于實時監測箱內色譜柱的溫度[11]。溫控板通過讀取傳感器溫度與目標設定值進行比對,控制制冷熱片加熱或制冷。

圖3 恒溫控制系統實物圖

2.3 熒光檢測器

為保證耦合效率,熒光檢測器采用緊湊結構,整個檢測器由光源模塊和信號采集模塊組成。其中光源模塊包括LED驅動電路和光路結構。信號采集模塊包括PMT和CPLD計數電路。圖4和圖5分別為熒光檢測器原理圖和實物圖。檢測器采用LED(索雷博,LED370E)作為光源,單色光經透鏡準直后垂直入射石英玻盒。此時流經玻盒的流動相中若混有被分離的AFT,在LED紫外光(365 nm)的激發下就會產生熒光,熒光信號經透鏡聚光準直、濾光片(440 nm)濾除雜散光后被PMT檢測窗口接收。PMT將光信號轉換為電脈沖信號,最終被CPLD計數電路采集以光子數的形式反映熒光信號強弱。

圖4 熒光檢器檢測原理圖

圖5 熒光檢測器實物圖

為保證LED光功率的穩定,系統采用閉環控制方式給LED供電。圖6為光強反饋驅動電路。采用ADI公司的ADN2830集成芯片,芯片偏置電流輸出范圍在4 mA～200 mA,支持可編程報警機制,可軟件控制光源驅動器。其中PSET引腳為光功率設置引腳,可接光電池來監測LED的光功率,IBIAS引腳為偏置電流輸出引腳,接LED。芯片通過光電池反饋光強從而調節IBIAS引腳輸出電流的大小,采用閉環控制方式保證了LED光功率的恒定。光功率的大小可以通過改變R3的阻值來調節(本電路中選用24 kΩ)。

圖6 光強反饋驅動電路

檢測器模塊的PMT采用日本濱松公司的H10682-210光子計數探頭,該探頭包含了一個金屬封裝型光電倍增管,高速光子計數電路和高壓電源。它的計數靈敏度(400 nm)可以達到6.1×105s-1·pW-1,典型暗計數為50 s-1,計數線性為5.0×106s-1,脈沖對分辨率為20 ns。其輸出信號為電脈沖信號,直接由CPLD計數電路采集。

激發的熒光信號強度與AFT的濃度呈正相關關系,為保證高濃度時計數不溢出,計數模塊必須要有寬范圍的線性計數范圍。以20 MHz頻率為計數上限,一般的單片機難以達到要求,本系統采用Altera公司的EPM240T100C5N芯片作為計數模塊的主芯片。該芯片的最大工作頻率可達304 MHz,采用該公司開發的QUATUUS Ⅱ軟件,使用Verilog語言來進行軟件開發。

2.4 主控板

主控板實現數據的傳輸和控制。采用ST公司的STM32F103RCT6單片機,它的最大工作時鐘為72 MHz,擁有256K FLASH,48 K SRAM,5個串口,8個16位定時器,SPI通信[12]功能。主控制板主要功能如下:

(1)利用定時器精確定時0.1 s,通過SPI定時讀取CPLD的計數值,并將計數值通過串口傳給上位機。

(2)利用定時器精確定時2 s,通過串口定時查詢泵的壓力值,并將壓力值通過串口傳給液晶屏及上位機。

(3)利用定時器精確定時3 s,通過串口定時查詢溫控板的溫度,并將溫度通過串口傳給液晶屏及上位機。

(4)通過讀取IO電平控制PMT和LED的開關,通過串口發送指令控制泵的開關;接收進樣閥的同步信號,控制計數的同步開始與停止。

(5)通過串口定時更新溫度和壓力值以及儀器的工作狀態。

(6)通過串口接收上位機的下發指令,上傳泵壓力,柱溫箱溫度,計數值等數據;接收上位機的控制指令,控制泵、LED以及計數功能的開與關,設定泵的流量、柱溫箱的溫度。

2.5 電源模塊

圖7為儀器供電需求分析圖。總電源為外接的220 V交流電,通過100 W的開關電源將交流220 V轉換成直流24 V,再由DC/DC模塊將直流24 V轉為直流5 V。CPLD計數電路、主控板以及恒溫控制系統的3.3 V直流電由SPX1117M3-3.3的穩壓芯片由直流5 V轉化而來。

圖7 供電需求分析圖

2.6 其他模塊

RS232/485轉網口模塊采用了聯創科技的一款型號為SL0110的產品,實現本地數據與以太網數據的交換[13]。液晶屏采用了谷鑫公司一款型號為MT32240A035的產品。該液晶屏分辨率為320像素×240像素,通信波特率為115 200,實時顯示柱溫箱的溫度、輸液泵的壓力、泵和LED的開關狀態以及整個儀器的工作狀態。

3 通信協議

3.1 通信協議定義

除了CPLD計數電路與主控板之間采用SPI進行數據傳輸,主控板、恒溫控制系統、分離系統以及上位機之間均采用串口進行數據傳輸。根據實際需求,設計表1通信協議幀。其中指令位分別為下發指令0x1010,查詢指令0x1001,數據校驗采用數據段按位異或方式。

表1 協議幀結構

*為具體指令編碼

3.2 數據字段內容

整個數據協議幀共16 byte,其中數據字段的內容與長度如表2所示。

表2 協議幀數據段結構

圖8 DS18B20溫度采集流程圖

4 系統軟件設計

4.1 流程圖

柱溫箱的溫度通過DS18B20定時采集,最終上傳給液晶屏和上位機。圖8是溫度采集流程圖。

主控板主要負責數據的傳輸與控制。柱溫箱的溫度、泵的壓力以及CPLD計數值等均由主控板接收,最終將所有數據打包以RS232方式上傳給液晶屏和上位機。圖9是主控板工作流程圖。

圖9 主控板工作流程圖

4.2 上位機軟件

上位機包括采用C#開發的具有讀寫串口、曲線繪制功能的測試軟件以及實際應用測試采用的清博華科技公司開發的色譜工作站。

5 性能測試

5.1 CPLD計數功能測試

CPLD計數電路的計數上限、計數誤差以及計數穩定性對儀器的檢測限、精度以及重復性均有很大影響,所以做了計數性能測試。

測試條件:采用Agilent公司81150A型號的信號發生器模擬光子經PMT轉換后的電脈沖信號。輸入占空比為50%、Vpp為2.5 V的矩形波信號,通過串口調試助手接收CPLD的計數值。

測試結果:實際最大計數值可以達到44 MHz,計數誤差約為0.04%,最大計數波動值為38(44 MHz頻率信號輸入),滿足實際設計需要。

5.2 黃曲霉毒素檢測的應用測試

液相色譜條件:色譜柱:Vertex-C18色譜柱;流動相:V(水)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=50∶35∶15;流速:1 mL/min;進樣量:20 μL;柱溫:25°C;LED激發中心波長:365 nm;熒光發射中心波長:440 nm。

測試試劑:如表2所示采用6種不同濃度的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2標準混合試劑進行測試,采用B1、G1濃度為2 μg/L,B2、G2濃度為0.005 μg/L標準混合試劑進行檢出限測試。

表2 7種不同濃度的標準混合試劑

單位:μg/L

測試圖譜:圖10為B1、G1濃度為2 μg/L,B2、G2濃度為0.5 μg/L的標準混合試劑測試所得的譜圖。圖中從左到右分別為AFG2、AFG1、AFB2、AFB1的4個標準峰。

圖10 G2、G1、B2、B1標準混合試劑色譜圖

測試結果:圖11為AFB1的標準曲線圖,由圖10可以看出在0.25 μg/L～8.0 μg/L之間AFB1具有較好的線性關系[15]。G2、G1、B2、B1檢測結果的線性關系如表3所示,檢測精度、重復性和檢出限如表4所示。由表3和表4可知儀器的線性度、檢測精度以及重復性均較好。其中G1、B1的檢出限可以達到0.1 μg/kg,這一數值低于歐盟限量標準(B1<2 μg/kg)[16]。

圖11 AFTB1標準曲線圖

AFT線性范圍/(μg/L)線性方程相關系數G20.063～2.000y=3.1742x+1.8428≥0.9997G10.250～8.000y=0.7863x+0.2424≥0.9996B20.063～2.000y=4.9307x+1.5064≥0.9997B10.250～8.000y=1.5858x+0.5484≥0.9995

表4 4種AFT重復性和檢出限

6 結論

設計并完成了一套緊湊型結構的黃曲霉毒素檢測系統,采用不同濃度的AFT標準混合試劑進行測試。測試結果表明該儀器性能穩定,檢測速度較快。4種AFT的r值均大于0.999 5,RSD均小于4%,說明儀器的線性度和精密度良好。G1、B1的檢出限可以達到0.1 μg/kg,G2、B2的檢出限可以達到0.005 μg/kg,能用于黃曲霉毒素的實際檢測。

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Design and Implementation of Aflatoxin Rapid Detection System*

LUQinjia1,2,CAIQiang1,2*,SHENGuojin2,WANGZhenhua2

(1.Electronic Information Institution of HangzhouDianziUniversity,Hangzhou 310018,China;2.Yangtze Delta Region Institute of TsinghuaUniversity,Jiaxing Zhejiang 314006,China)

An integrated structure of aflatoxin detection system is designed and implements based on high-performance liquid chromatography with fluorescence method. This detection system consists of separation system,constant temperature control system,fluorescence detector,main control board and human-machine interface components. It separates aflatoxin by separation system and inspires aflatoxin producing fluorescence by the fluorescence detector. It uses photon counting method to collect the signal and finally through the PC of the chromatography workstation to display the detection results. Test results show that this system has good stability,compact structure,high detection speed and high sensitivity. It can be used for the actual detection of aflatoxin.

high performance liquid chromatography with fluorescence;aflatoxin detection;fluorescence detector;photon counting

項目來源:國家重大科學儀器設備開發專項項目(2012YQ15008705);浙江省科技計劃項目(2015C33009);嘉興市科技計劃項目(2015AY11013)

2016-04-22 修改日期:2016-07-19

TP23

A

1005-9490(2017)03-0748-06

C:7210;7320T

10.3969/j.issn.1005-9490.2017.03.046