六月雪提取物及其單體成分對LPS刺激RAW 264.7巨噬細胞分泌NO和IL—6的影響

郭培++柳航++朱懷軍++叢友權++葛衛紅

[摘要] 目的 研究六月雪提取物及單體對脂多糖（LPS）誘導RAW 264.7巨噬細胞的抗炎作用，確定六月雪抗炎作用活性成分。 方法 體外細胞毒性試驗建立調零組、對照組、給藥組，采用噻唑藍（MTT）法檢測終濃度為10、20、40、80、100、200、300、400 μg/mL的六月雪水提物，70%乙醇提取物及單體化合物對RAW 264.7細胞活性的影響；依據體外細胞毒性實驗結果確定后續實驗給藥濃度，建立對照組、模型組、給藥組，采用一氧化氮（NO）試劑盒法、酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測六月雪提取物及其單體對LPS誘導RAW 264.7細胞分泌一氧化氮（NO）以及白細胞介素-6（IL-6）的影響。結果 相較于對照組，模型組RAW 264.7細胞NO表達顯著升高（P < 0.05）；與模型組相比，六月雪70%乙醇提取物及lyx-1、lyx-4～5能抑制NO、IL-6的分泌（P < 0.05）。結論 六月雪抗炎活性成分主要存在于70%乙醇提取物中，主要抗炎成分是丁香樹脂酚、（7′S，8S，8′R）-4，4′-二羥基-3，3′，5，5′-四甲氧基-7′，9-環氧木脂烷-9′-醇-7-酮、（7R，7′R，7′R，8S，8′S，8′S）-4′，4′-二羥基-3，3′，3′，5-四甲氧基-7，9′：7′，9-雙氧環-4，8′-氧-8，8′-倍半新木脂烷-7′，9′-二醇。

[關鍵詞] 六月雪；抗炎活性；一氧化氮；白細胞介素-6

[中圖分類號] R961 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（a）-0043-05

[Abstract] Objective To study the protective effect of extract from Serissa japonica on the lipopolysaccharides （LPS）-inflammatory response of macrophage cell line RAW 264.7 in mice， and to determine the anti-inflammatory active components from Serissa japonica. Methods In vitro cytotoxicity test， the block group， the control group and the medicine group were set up， the effect of aqueous extract， 70% ethanol extract and major monomer components （10， 20， 40， 80， 100， 200， 300， 400 μg/mL） on RAW 264.7 cell viability was examined by MTT assay. According to the results of in vitro cytotoxicity test， the control group， the model group and the medicine group were determined， the NO kit assay and the enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） were adopted to detect the NO and interleukin-6 （IL-6） release of extract and major monomer components on LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Results Compared with the control group， the expressions of NO were significantly increased in LPS-induced RAW 264.7 cells of model group （P < 0.05）. Compared with the model group， 70% ethanol extract and lyx-1， lyx-4，lyx-5 could inhibit the increase of NO and IL-6（P < 0.05）. Conclusion Active anti-inflammatory compositions of the Serissa japonica mainly exist in 70% ethanol extract， episyringaresinol， （7′S，8S，8′R）-4，4′-dihydroxy-3，3′，5，5′-tetramethoxy-7′，9-epoxylignan-9′-ol-7-one， （7R，7′R，7′R，8S，8′S，8′S）-4′，4′-dihydroxy-3′，3′，3′，5-tetramethoxy-7，9′：7′，9-diepoxy-4，8′-oxy-8，8′-sesquineolignan-7′，9′-diol are the major anti-inflammatory components.

[Key words] Serissa japonica； Anti-inflammatory activity； Nitric oxide； Interleukin-6

六月雪Serissa japonica （Thunb.） Thunb.是茜草科白馬骨屬植物，《安徽藥材》載：“與老母雞同煮，能治慢性腎炎水腫?！薄逗纤幬镏尽份d：“主治小兒驚風，腹痛，目翳，齒痛，腎炎?！薄陡＝ㄋ幬镏尽份d：“主治久瀉，水腫，頸淋巴結核，腎盂腎炎?！辟F州一帶民間醫生用其治療胃腸炎、腎盂腎炎、水腫、疳積、痢疾等疾病[1-2]。南京鼓樓醫院制劑由荔枝草、車前草、六月雪、紫花地丁4味中藥組成，用于治療泌尿系統感染、腎盂腎炎等[3-4]。目前國內外多研究復方六月雪藥的抗炎效果[5-7]，對單味中藥六月雪及其中單體化合物研究尚少。本研究通過LPS刺激小鼠巨噬細胞RAW 264.7構建炎癥模型[8-9]，探究六月雪水提物、70%醇提物及其單體的抗炎效果，考察單味藥六月雪及其中單體化合物的抗炎活性，為六月雪抗炎作用提供理論基礎。

1 儀器與材料

1.1試劑

DMEM高糖培養基（E500003）、胎牛血清FBS（E600001）、胰蛋白酶細胞消化液（E607001）、PBS（E607008）、青霉素-鏈霉素溶液（E607011）、四甲基偶氮唑鹽MTT（A100793）、二甲基亞砜DMSO（A100231）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；脂多糖LPS B5：O55（Sigma 公司，110M4086V）；一氧化氮檢測試劑盒（S0021）購自碧云天生物研究所；IL-6（E0049Mo）購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司。

1.2儀器

2424-2型二氧化碳培養箱（SHELLAB）；SH03014低溫高速離心機（美國科俊儀器公司）；CKX41SF型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化）；YXQ.SG41.280型手提式壓力蒸氣滅菌器（上海華線醫用核子儀器有限公司）；ELx800光吸收酶標儀（Bio Kit）；AG-245型1/萬電子分析天平（METTLER TOLEDO）；HY-4多用脫色搖床（江蘇金壇市正基儀器廠）；DW-86L626型超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）。

1.3 藥材

六月雪購自南京藥業股份有限公司，經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定為茜草科白馬骨屬六月雪Serissa japonica （Thunb.） Thunb.全草。樣本保存于鼓樓醫院藥學部，編號：gl201410002。

2 方法與結果

2.1 六月雪的提取分離

六月雪全草100 g，用70%乙醇回流2次，每次2 h，60℃減壓濃縮得到浸膏后凍干得3.0815 g[10]。取六月雪全草100 g，純水回流2次，每次2 h，60℃減壓濃縮得到浸膏后凍干得2.780 g[11]。單體化合物為70%乙醇提取物濃縮后浸膏采用高效液相提取分離，分別為丁香樹脂酚、8-羥基杜仲樹脂酚、8-羥基松脂酚、（7′S，8S，8′R）-4，4′-二羥基-3，3′，5，5′-四甲氧基-7′，9-環氧木脂烷-9′-醇-7-酮、（7R，7′R，7′R，8S，8′S，8′S）-4′，4′-二羥基-3，3′，3′，5-四甲氧基-7，9′：7′，9-雙氧環-4，8′-氧-8，8′-倍半新木脂烷-7′′，9′-二醇，依次記做lyx-1～5。

2.2 細胞培養

采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養基，將小鼠RAW 264.7細胞在37℃、5%CO2培養箱中培養，實驗選用對數生長期細胞[12]。

2.3 細胞毒活性實驗

胰酶消化細胞2 min后充分吹打混懸細胞，細胞密度為6×104個/mL，200 μL/孔接種于96孔板。設置調零組（培養基）、對照組（細胞+培養基）、給藥組（終質量濃度為10、20、40、80、100、200、300、400 μg/mL），每組設5個復孔。將96孔板置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養過夜，棄去原培養液，每孔加入100 μL含1 mg/mL MTT的PBS，37℃下孵化4 h，吸除MTT，每孔加入150 μL DMSO，搖床振蕩10 min，490 nm處測定吸光度值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）= （藥物孔測定值-調零孔測定值）/（對照孔測定值-調零孔測定值）×100%。

2.4 一氧化氮含量測定

給藥組濃度根據“2.3”實驗結果確定，以細胞80%存活率濃度為實驗最高濃度，逐級降低，試圖得到最小有效抗炎濃度[14-16]。將RAW 264.7細胞懸液接種于48孔板，細胞密度為1×105個/mL，每孔500 μL，培養箱中培養過夜，設對照組（只加入培養液），模型組（LPS終濃度為1 μg/mL），給藥組（分別為終濃度1 μg/mL的LPS+終濃度為2、10、25、50、100、200、300 μg/mL的lyx-3；終濃度1 μg/mL的LPS+終濃度為2、10、25、50、100、200 μg/mL的六月雪水提物、70%乙醇提取物、lyx-5；終濃度1 μg/mL的LPS+終濃度為2、10、25、50、100 μg/mL的lyx-1～2、lyx-4），每組4個復孔。將48孔板置于37℃、5%CO2培養箱中培養過夜后取出，吸取細胞上清液，按照NO試劑盒步驟操作，于酶標儀540 nm處測定OD值，計算NO的含量。

2.5 IL-6含量測定

RAW264.7細胞密度及加藥處理方法同“2.4”。培養板放入37℃、5%CO2的細胞培養箱內培養24 h后，取培養液上清液，ELISA 法測定細胞培養上清液中細胞分泌的IL-6含量。以檢測波長為450 nm在多功能微孔板分析儀上測定吸光度值。

2.6 數據統計分析

應用SPSS12.0軟件進行統計學分析，實驗數據以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P < 0.05 認為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 提取分離化合物

從六月雪70%乙醇提取物中分離得到5種單體化合物[17]，結構見圖1。

3.2對細胞活性的影響

考察不同濃度的六月雪水提取物、70%乙醇提取物及單體成分對RAW264.7細胞增殖的影響。與對照組比較，lyx-3濃度低于300 μg/mL，水提物、70%乙醇提取物、lyx-5濃度低于200 μg/mL，lyx-1～2、lyx-4濃度低于100 μg/mL時對細胞增殖沒有顯著抑制或促進作用。因而，lyx-3以濃度2、10、25、50、100、200、300 μg/mL，水提物、70%乙醇提取物、lyx-5以濃度2、10、25、50、100、200 μg/mL，lyx-1～2、lyx-4以濃度2、10、25、50、100 μg/mL作為后續實驗的給藥濃度。

3.3六月雪提取物及單體化合物對LPS誘導細胞NO分泌的影響

采用Griess試劑法測定六月雪提取物及單體對LPS誘導RAW 264.7細胞上清液中NO分泌的影響。與對照組比較，模型組細胞上清液NO分泌增加。相較于模型組，給予六月雪70%乙醇提取物后，25、50、100、200 μg/mL劑量組均可明顯降低NO的表達（P < 0.01），六月雪水提物對NO的表達并無影響。5種單體中，僅lyx-1、lyx-4～5能抑制NO分泌，具有抗炎效果。單體化合物濃度亦會影響其抗炎效果，不同濃度各提取物及單體化合物對細胞分泌NO的影響見圖2～8。

3.4 對LPS誘導細胞IL-6分泌的影響

與對照組比較，模型組細胞上清液中IL-6分泌量顯著上調（P < 0.01）。與模型組比較，200 μg/mL六月雪70%乙醇提取物能顯著抑制IL-6分泌（P < 0.05）；而六月雪水提取物組對IL-6分泌無顯著影響；lyx-1、lyx-4～5均對RAW 264.7細胞分泌IL-6有不同程度的抑制作用，而lyx-2、lyx-3對RAW 264.7細胞分泌IL-6無影響。見圖9～15。

4 討論

觀察單體化合物結構發現，lyx-2～3、lyx-5基本母核一致，與lyx-1區別于8位的-OH，僅lyx-1對NO、

IL-6的分泌具有顯著的抑制作用，表明8位-OH可能對藥物與受體結合存在位阻，從而不能有效抗炎。由此發現取代基位置可能會直接影響單體化合物的藥理活性，可以嘗試結構修飾達到改善藥理作用的目的。

綜上，本實驗從六月雪70%乙醇提取物得到5種單體化合物，并借助1H-NMR，13C-NMR等解析結構并對照文獻[18-20]，確定化學結構，使用LPS誘導RAW 264.7細胞建立體外炎癥模型，對六月雪提取物及單體進行活性篩選。結果表明，六月雪70%乙醇提取物、丁香樹脂酚、（7′S，8S，8′R）-4，4′-二羥基-3，3′，5，5′-四甲氧基-7′，9-環氧木脂烷-9′-醇-7-酮、（7R，7′R，7′R，8S，8′S，8′S）-4′，4′-二羥基-3，3′，3′，5-四甲氧基-7，9′：7′，9-雙氧環-4，8′-氧-8，8′-倍半新木脂烷-7′，9′-二醇。

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（收稿日期：2017-01-05 本文編輯：王 麗）