立論于肝脾同治研究逍遙散對老年性癡呆模型鼠行為學及神經可塑性的影響

李瓊鋒 杜義斌 趙 義

(云南省中醫醫院老年病科,昆明,650021)

立論于肝脾同治研究逍遙散對老年性癡呆模型鼠行為學及神經可塑性的影響

李瓊鋒 杜義斌 趙 義

(云南省中醫醫院老年病科,昆明,650021)

目的:立論于肝脾同治研究逍遙散對老年性癡呆模型鼠行為學及神經可塑性生長相關蛋白(GAP-43)和突觸素(SYN)的影響。方法:72只健康SPF級雄性大鼠,根據隨機數子表法隨機分為3組,假手術組、癡呆組和逍遙散組,每組各24只。癡呆組和逍遙散組進行老年癡呆AD大鼠的模型制備,假手術組:常規飼料飲水SPF級飼養;癡呆組:在空白組的基礎上,給予等量0.2 mL/10 g無菌生理鹽水灌胃;逍遙散組:在空白組的基礎上,逍遙散水煎液,給予0.2 mL/10 g的逍遙散水煎液灌胃。1次/d,療程6周。采用Y型迷宮進行大鼠的學習記憶行為檢測,透射電子顯微鏡(TEM)觀察海馬CA1區突觸結構,免疫組化檢測海馬CA1區生長相關蛋白(GAP-43)的表達情況,蛋白質印跡法(Western Blot)檢測突觸素(SYN)的表達情況。結果:1)與假手術組比較,癡呆組和逍遙散組中EN均增加(P<0.05),CN均減少(P<0.05);其中逍遙散組EN低于癡呆組(P<0.05),CN則高于癡呆組(P<0.05)。2)TEM下觀察假手術組突觸結構和形態正常,逍遙散組大鼠海馬CA1區突觸結構和形態均較癡呆組規則(P<0.05)。3)與假手術比較,癡呆組和逍遙散組GAP-43和SYN表達均下調(P<0.05),而逍遙散組中GAP-43和SYN的表達則高于癡呆組(P<0.05)。結論:逍遙散(肝脾同治)有效改善老年性癡呆模型鼠的學習記憶行為學和突觸結構形態,其機制可能與上調了生長相關蛋白(GAP-43)免疫組化8和突觸素(SYN)神經可塑性相關蛋白有關。

肝脾同治;逍遙散;老年性癡呆;行為學;神經可塑性

老年性癡呆即阿爾茲海默病(Alzheimer′sdisease,AD)，是機體大腦皮質不斷退化而出現不同認知領域減退的中樞神經系統變性疾病,目前發病原因尚不明了。中醫學患者年老體虛,氣血津液虧虛,因虛致瘀,痰濁蒙竅,腦竅失養而出現此癥,因此我們認為AD病因病機不外乎虛、瘀、痰三者。《素問》一書中描述到:“肝為將軍之臟,喜調達而惡抑郁”,《臨證指南醫案.肝風》有“肝體陰而用陽”,《難經》曰:“脾藏二神意與智,意不安,思無慮,神奪愚也”,脾乃后天之本,氣血生化之源,脾氣健運氣血生化有源則可上達濡養腦竅,下滲于腎以充髓海,因此我們認為治療AD的核心在于肝脾兩臟。《逍遙散》首載于《太平惠民和劑局方》一書,是肝脾同治之經典方,可通過土木同調,從而實現氣血并治,則血充腦靈,氣暢神安。我們在臨床立論于肝脾同治理論,利用逍遙散治療老年性癡呆,獲得理想療效,現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 72只購于昆明楚商科技有限公司的健康SPF級雄性大鼠,平均體重(280±21)g,飼養環境設置:室溫23～25 ℃,相對濕度(56±6)%。

1.2.2 儀器 腦立體定位儀(北京拜安吉科技有限公司提供,型號:SR-5R),干粉劑(首都醫科大學宣武醫院多肽室提供),10%水合氯醛(武漢遠成共創科技有限公司生產)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 根據隨機數子表法隨機分為3組,假手術組、癡呆組和逍遙散組,每組24只。老年癡呆AD大鼠的模型制備,10%水合氯醛按照大鼠體重腹腔注射麻醉(4 mL/kg),固定在大鼠腦立體定位儀上,常規備皮,分離暴露顱骨,參照包新民《大鼠腦立體定位儀圖譜》在右側前囟后3.0 cm,中線右側2.0 cm,馬克筆標記定點,用牙科鉆轉開顱骨,微量注射器垂直進針2.5 cm定位海馬區,緩慢注射5 μL的凝聚態Aβ1-42,凝聚態的制備是將Aβ1-42干粉劑溶于2 g/L的無菌生理鹽水中。注射完以后留針5 min再出針并縫合皮膚。假手術組同上方法注入5 μL的無菌生理鹽水。

1.2.2 干預方法 1)假手術組:常規飼料飲水SPF級飼養;2)癡呆組:在空白組的基礎上,給予等量0.2 mL/10 g無菌生理鹽水灌胃;3)逍遙散組:在空白組的基礎上,逍遙散(柴胡、當歸、白芍、白術、茯苓、生姜各15 g、薄荷5 g)水煎獲取逍遙散水煎液,給予0.2 mL/10 g的逍遙散水煎液灌胃，1次/d,療程為6周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 老年癡呆行為學檢測 治療結束后,各組大鼠采用Y型迷宮進行大鼠的學習記憶行為檢測,觀察其學習記憶能力。將大鼠放于Y型迷宮中適應5 min熟悉環境,起步區,安全區等,開始試驗后選擇安靜黑暗的環境,設定75 V電壓,通電后若大鼠10 s內一次性跑到安全區,即為“正確反應”,否則為“錯誤反應”。安全區無規則變換,每次測試間隔1 min,連續測試重復,記錄大鼠達到學會標準(10次中有9次為正確反應),錯誤反應次數(EN),越小學習能力越強;正確反應次數(CN),是學習測試24 h后,連續電擊10次的記錄,值越大記憶能力越強。

1.2.3.2 透射電子顯微鏡(TEM)觀察海馬CA1區突觸結構 治療后每組8只大鼠麻醉猝死,取腦分離大鼠海馬CA1區,迅速用2%戊二醛和l%鋨酸后固定l h,常規脫水、固定和環氧樹脂包埋,超薄切片機(LKB-8800,瑞典)切片,醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色,透射電子顯微鏡(JEM-2100日本電子株式會社)下觀察并拍片。

1.2.3.3 免疫組化檢測海馬CA1區生長相關蛋白(GAP-43)的表達情況 治療后每組8只大鼠麻醉猝死,斷頭取腦,4%多聚甲醛固定,隨后采用常規梯度酒精進行脫水,石蠟包埋后連續冠狀切4 μm厚度片。根據GAP-43免疫組化試劑盒(CST公司,美國),標準SP法操作,DAB顯色,顯微鏡觀察GAP-43的表達情況。

1.2.3.4 蛋白質印跡法(Western Blot)檢測突觸素(SYN)的表達情況 治療后每組8只大鼠麻醉斷頭取腦放入液氮中,腦組織研磨提取蛋白上清液,BCA測定蛋白含量,計算上樣量,配置SDS-PAGE蛋白電泳膠,常規電泳,轉膜,封閉雜交和ECL曝光顯影,掃描成像,用ImageLab進行圖像分析。GAPDH作為內參。試劑均購于CST公司。

1.3 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件進行統計學分析,多組間采用單因素方差分析,兩兩比較采用獨立樣本t檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠學習記憶行為學比較 與假手術組比較,癡呆組和逍遙散組中EN均增加(P<0.05),CN均減少(P<0.05);其中逍遙散組EN低于癡呆組(P<0.05),CN則高于癡呆組(P<0.05)。見表1。

2.2 TEM觀察大鼠海馬CA1區突觸超微結構變化 TEM下觀察假手術組突觸結構和形態正常,逍遙散組大鼠海馬CA1區突觸結構和形態均較癡呆組規則(P<0.05),逍遙組中突觸前區分布均勻,小泡豐富,較少線粒體凝聚。見圖1。

表1 各組大鼠學習記憶行為學比較

注:與假手術組比較,*P<0.05;與癡呆組比較,△P<0.05。

圖1 TEM大鼠海馬CA1區突觸超微結構變化(40 000×)

2.3 各組免疫組化GAP-43的表達情況 免疫組化GAP-43表達上癡呆組較假手術組陽性細胞數減低(P<0.05),而逍遙散組中GAP-43的陽性細胞數則高于癡呆組(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組免疫組化GAP-43的表達情況(400×)

圖3 不同組別Western Blot條帶結果

圖4 不同組別Western Blot灰度值結果

注：與癡呆組比較,*P<0.05;與假手術組比較,#P<0.05。

2.4 各組大鼠Western Blot中SYN表達情況 與假手術比較,癡呆組和逍遙散組Western Blot中SYN表達均下調(P<0.05),而逍遙散組中SYN的蛋白表達則高于癡呆組(P<0.05)。見圖3、圖4。

3 討論

《素問·經脈別論》一書中曰:“食氣入胃,散精于肝,淫氣于筋”，我們認為此句話應理解為食氣入胃,透過脾的運化,將營養散播到全身。這體現了古代醫賢認為脾為后天之本之觀點,脾氣健運,氣血生化有源,飲食水谷精微不斷輸送至肝臟以滋養全身筋骨脈絡,所以元代李杲在其《脾胃論·脾胃盛衰論》中描述:“百病皆由脾胃衰而生也”。現代解剖學資料證實被胃腸道所吸收的營養物質隨之進入胃腸外血絡,隨后進入肝門靜脈,部分營養物質停留于肝臟內以肝糖原形式儲存,這就醫圣張仲景“肝主筋,故胃散谷氣于肝,則浸淫滋養于筋也”的觀點一致,清末名醫柳寶詒在其臨床醫冊中記載:“血藏肝,而生于脾……滋潤肝陰尤應培土,以補營血之源”,上述醫賢的觀點充分體現了肝脾同治的重要性[1]。對大量傳統醫學文獻進行研讀,并根據循證醫學研究結果我們認為AD的發生發展與肝脾兩臟的病變密不可分,肝藏血主疏泄,與情志調節及思憶息息相關,精血同源,肝血充則髓海盈,若肝血虧虛不能涵養怒志而致情志失調,氣機不暢而郁結成病,皆可發為癡呆。《難經》一書云:“脾藏意與智”,《醫方類聚》亦有記載:“脾藏二神意與智”,脾乃后天之本,腎為后天之本,先天養后天,活力資助,后天養先天,培育充養,如若脾氣虧虛,氣血生化乏源,則上無法充盈腦竅,下無法培育腎精而髓海化生無源。此外,脾主運化,脾虛則水濕內停,痰濁叢生,肝失疏泄則氣機散布不暢,導致氣滯血瘀,上沖蒙于清竅,神明失養而成呆病。基于上述理論我們從肝脾同治著手探討治療AD的臨床思路,以逍遙散為手段對AD模型大鼠進行治療,結果顯示逍遙散理想地提高了AD大鼠行為學習能力,這說明肝脾同治符合AD的治則。逍遙散源自《太平惠民和劑局方》,是疏肝調脾的經典名方,實現氣血兼顧、肝脾同調的目的。方中柴胡疏肝解郁,肝氣調達,處君藥之位,當歸養血和血,白芍養血斂陰,柔肝緩急,三藥合用補肝體而助肝用,血和其肝和,血充則肝柔,當歸聯合白芍共為臣藥以藏神魂,舍意智。木郁不達而致脾虛不運,故加白術、茯苓、甘草以益氣健脾,既可實土以御木侮,又可充盈氣血生化之源,以解蒙蔽,聰神明,共為佐藥。方中加少許薄荷以加強悅神魂、暢情志之功,生姜溫運和中,辛散達郁,亦為佐藥。諸藥合用,氣血并治,肝脾兼顧,使筋肉并健,清陽得升而氣機得暢,精氣上注則神明得安,氣暢神安,腦脈得養,神聰自和,組方嚴謹,具有中藥治療AD的理論基礎。

近年來隨著分子生物學研究的日益深入,研究人員發現認知功能與神經元突觸的可塑性關系密切[2-4]。中樞神經系統的可塑性存在于各級環節,包括神經網絡、突觸連接以及神經環路等,其中突觸是最不穩定因素,亦是可塑性的關鍵環節[5-6]。最新研究顯示GAP-43對神經的生長、再生以及突觸形態、功能的維持有著重要作用,甚至被視為神經再塑的標志性因子[7-8]。根據超微結構研究發現隨著神經元的生長或再生,神經組織內有大量GAP43在突觸組織合成,并分布于軸突生長錐質膜面中,不斷刺激生長錐質膜面從而實現促進軸突生長的目的,胚胎時期GAP-43大量分泌以促進神經元生長發育,隨著機體逐漸發育成熟GAP43濃度逐漸降低,但在新皮質、海馬等組織GAP-43仍以較高水平分布于此[9-10]。當修復受損腦組織時,側枝長芽及反應性軸突再生均有GAP-43濃度的變化,在本研究中我們發現AD模型大鼠腦組織GAP-43濃度大量減少,而隨著逍遙散的使用,AD大鼠腦組織的GAP-43反應性增多,從而促進了神經元的不斷修復,促進病情發育。在研究中我們同時檢測了SYN的濃度變化,我們可以清楚觀察到經過AD造模的大鼠SYN濃度急劇減少,而逍遙散組大鼠雖然SYN濃度較假手術組減少,但與AD組比較明顯上調,這說明逍遙散改善AD模型大鼠認知可能還與改變SYN蛋白濃度有關。SYN蛋白是突觸前終末的特異性蛋白因子之一,其濃度變化直接體現了反應體內突觸的數量及分布情況[11-15],有研究人員利用醫學手段改善癡呆大鼠腦血流的同時發現促進了新的樹突和軸突生長,于此同時檢測到SYN濃度隨之上調,我們在研究中亦利用電鏡對不同組別大鼠的突觸超微結構進行觀察,結果發現逍遙散組大鼠海馬CA1區突觸結構和形態均較癡呆組規則,逍遙組中突觸前區分布均勻,小泡豐富,較少線粒體凝聚,與此同時我們利用Western blotting技術觀察到SYN蛋白在隨著突觸形態改善的同時水平逐漸上調,因此我們有理由相信逍遙散通過增加SYN的表達從來他促進突觸重建。

通過一系列實驗研究,我們發現逍遙散可改善AD模型大鼠的認知能力,于此同時,其明顯修復了突觸的形態,而這一作用機制可能與上調GAP-43及SYN等突觸相關性蛋白濃度有關。

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(2017-03-27收稿 責任編輯：王明)

Effect of Xiaoyao Powder on Praxiology and Neural Plasticity in Rats with Alzheimer′s Diseases from Simultaneous Treatment in Liver and Spleen Theory

Li Qionfeng, Du Yibin, Zhao Yi

(GeratologyDepartment,YunnanMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Kunming650021,China)

Objective: To study the effect of Xiaoyao Powder on praxiology and neural plasticity of growth protein (GAP-43) and synaptophysin (SYN) in rats with alzheimer′s diseases from simultaneous treatment in liver and spleen theory. Methods: Seventy-two healthy male SPF rats were randomly divided into 3 groups: sham operation group, dementia group and Xiaoyao Powder group, with 24 rats in each group. Rats in the dementia group and Xiaoyao Powder group had operation for senile dementia in AD model. Sham operation group

conventional feeding of grade SPF; dementia group was additionally treated with 0.2 mL/10 g sterile saline, while Xiaoyao Powder group received Xiaoyao Powder based on the blank group treatment and was given by 0.2 mL/10 g decoction lavage, once a day for 6 weeks. Y maze was applied for the study of learing and memorial behavior, and synaptic structure in hippocampal CA1 region was detected by transmission electron microscopy (TEM), immunohistochemistry was used to detect the expression of hippocampus CA1 growth protein (GAP-43), and Western blot (Western Blot) was applied to detect the expression of synaptophysin (SYN). Results: 1) Compared with the sham operation group, EN of the dementia group and Xiaoyao Powder group was increased (P<0.05) and CN decreased (P<0.05). EN in the Xiaoyao Powder group was lower than that of dementia group (P<0.05) and CN was higher than that in senile dementia group (P<0.05). 2) The structure and morphology of the synapses were observed in the sham operated group. The structure and morphology of CA1 in the hippocampus of the Xiaoyao Powder group were significantly lower than those in the dementia group (P<0.05). 3) Compared with sham operation group, the expression of GAP-43 and SYN in the dementia group and the Xiaoyao Powder group were all down-regulated (P<0.05), while the expression of GAP-43 and SYN in Xiaoyao Powder group was higher than that in dementia group (P<0.05). Conclusion: Xiaoyao Powder (from simultaneous treatment for Liver and spleen theory) may effectively improve the learning and memorial behavior of senile dementia model rats and its synaptic structure form. Its mechanism may be related to the up-regulation of growth associated protein (GAP-43) immunohistochemistry 8 and synaptophysin (SYN) on neural plasticity associated protein.

Liver and spleen; Xiaoyao Powder; Alzheimer′s disease; Praxiology; Neural plasticity

云南省科技計劃項目[編號:2015FB205(033)]

李瓊鋒(1966.12—),女,本科,副主任醫師,研究方向:老年常見病,E-mail:dlk5131568@sina.com

杜義斌(1968.07—),男,碩士,主任醫師,老年病二科主任,研究方向:老年常見病,E-mail:dybys@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.05.042