健康豬中豬鏈球菌的檢測(cè)技術(shù)與建議

雷宇平

【摘要】：豬鏈球菌病是由豬鏈球菌感染引起的一種常見(jiàn)傳染病。豬鏈球菌的感染不僅對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失，同時(shí)也對(duì)公共衛(wèi)生，尤其是相關(guān)的從業(yè)人員生命造成了危險(xiǎn)，嚴(yán)重感染會(huì)引起患者的死亡。豬鏈球菌可以引起豬的多種疾病侵害，各個(gè)年齡段的豬。豬鏈球菌通常以敗血癥，腦膜炎，關(guān)節(jié)炎，淋巴結(jié)炎為主要特征。人類在接觸病死豬，即可感染發(fā)病。本研究針對(duì)山西省部分豬場(chǎng)豬鏈球菌病的流行狀況進(jìn)行調(diào)查，在對(duì)送檢的病死豬和表觀健康豬，分別進(jìn)行了豬鏈球菌的分離鑒定，耐藥性分析，致病性分析和血清型鑒定。調(diào)查結(jié)果顯示病死豬分離到的豬鏈球菌占11.3%，而表觀健康豬則平均帶菌率為5.14%，分離菌株的致病性不同，不同豬場(chǎng)菌株的耐藥性也存在著差異。本研究旨在調(diào)查健康豬中豬鏈球菌帶菌者狀況，并揭示健康豬群攜帶豬鏈球菌的公共衛(wèi)生學(xué)建議，同時(shí)為豬鏈球菌病的流行病學(xué)調(diào)查提供資料，有利于制定控制此病在豬與豬之間，豬與人之間流行的策略。

【關(guān)鍵詞】：豬鏈球菌，健康豬，毒力因子

豬鏈球菌屬于鏈球菌屬，它可以根據(jù)菌體莢膜抗原特性的不同，可以分成35個(gè)血清型。其中豬鏈球菌2型，在世界上流行最廣，致病性最強(qiáng)，同時(shí)能引起人的感染，是一種重要的人畜共患病病原。國(guó)內(nèi)外均有屠宰場(chǎng)從業(yè)人員感染豬鏈球菌的報(bào)道，也被認(rèn)為是一種職業(yè)病。豬鏈球菌2型又稱豬鏈球菌血清2型或莢膜2型豬鏈球菌。豬鏈球菌2型主要引起斷奶仔豬，關(guān)節(jié)炎，腦膜炎，敗血癥及支氣管肺炎。并且健康豬種帶菌率達(dá)到了76%，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，也給公共衛(wèi)生帶來(lái)了威脅，從而受到了各有關(guān)方面的高度重視。此外，1型，7型，9型，14型也是引起豬感染的重要血清型。

1 檢測(cè)技術(shù)

1.1PCR鑒定

純化的疑似豬鏈球菌菌株，利用檢測(cè)谷氨酸脫氫酶基因進(jìn)行豬鏈球菌菌種的鑒定，若為gdh陽(yáng)性者再進(jìn)行1，2，7和9型豬鏈球菌的PCR定型。以參考菌種的DNA模版為陽(yáng)性對(duì)照，金黃色葡萄球菌的DNA模板為陰性對(duì)照，水為空白對(duì)照。

1.2血清學(xué)鑒定

取經(jīng)過(guò)PCR鑒定為豬鏈球菌的1，2，7，9型的分離株，豬鏈球菌1，2，7，9型參考菌株的24h Todd-Hweitt平板上的菌體，按常規(guī)方法進(jìn)行玻片凝集實(shí)驗(yàn)。凝集血清為豬鏈球菌1，2，7，9型標(biāo)準(zhǔn)抗血清。同時(shí)設(shè)PBS對(duì)照和菌體對(duì)照。

1.3毒力因子檢測(cè)

設(shè)計(jì)了擴(kuò)增溶菌酶釋放蛋白（MRP）、細(xì)胞外蛋白因子（EF）、溶血素（sly）、莢膜多糖（cps2A）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶編碼基因（gapdh）、纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合蛋白（FBPS）和orf2毒力相關(guān)基因的引物，以PCR方法對(duì)鑒定為豬鏈球菌1，2，7，9型分離株的6種毒力因子進(jìn)行檢測(cè)。所用于檢測(cè)mrp、epf的引物，可擴(kuò)增不同大小的mrp、epf片段，顯示mrp、epf的變化。

2 檢測(cè)結(jié)果

利用gdh特異性引物擴(kuò)增出688bp目的條帶者，為豬鏈球菌。經(jīng)過(guò)凝集試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除FL42與豬鏈球菌1型和2型標(biāo)準(zhǔn)血清反應(yīng)均呈陽(yáng)性，且菌體自身不凝集，判為1/2型，其余菌株均與PCR結(jié)果相符，僅與對(duì)應(yīng)血清型的標(biāo)準(zhǔn)抗血清發(fā)生凝集。

毒力因子譜分析發(fā)現(xiàn)，除TN63外，分離株均缺少1至4個(gè)毒力因子，分離株FL42，WZ10和BB214檢測(cè)到462bp的mrp片段，經(jīng)過(guò)BLAST發(fā)現(xiàn)此片段與西班牙豬鏈球菌分離株376的mrp3224-3685段的基因相同。

3討論

豬鏈球菌自然存在于上呼吸道，尤其是扁桃體和鼻腔中。豬群里的感染，多是因?yàn)橐腚癖馓殷w帶有病原體的表觀健康豬，而存在于腭桃體上的豬鏈球菌的血清型非常多變。鏈球菌的抗原結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，包括屬特異，群特意和型特異三種抗原。豬鏈球菌根據(jù)菌體莢膜抗原特性的不同，可以分成35個(gè)血清型。從病豬和健康豬分離出的豬鏈球菌血清型不同。從病豬分離的菌種的血清型主要是2型。從健康豬的分離株卻常見(jiàn)18，19，21型豬鏈球菌。豬鏈球菌2型有強(qiáng)致病力，弱致病力和無(wú)致病力菌株。從健康豬中分離到的豬鏈球菌2型中，溶菌酶釋放蛋白（MRP），胞外因子（EF），莢膜多糖均為陰性。而從發(fā)病豬分離的豬鏈球菌2型大多數(shù)為MRP+EF+表型。攜帶豬鏈球菌的健康諸是屠宰場(chǎng)工人感染豬鏈球菌病的潛在來(lái)源。豬鏈球菌2型可以在4℃以下存活六周，在22-25攝氏度下可以存活十二天。屠宰場(chǎng)引入帶菌動(dòng)物，工人工作時(shí)可能通過(guò)傷口感染環(huán)境和豬體上的豬鏈球菌，引發(fā)豬鏈球菌病。

豬鏈球菌的感染不僅對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失，同時(shí)也對(duì)公共安全衛(wèi)生尤其是相關(guān)的從業(yè)人員的生命造成了危險(xiǎn)，嚴(yán)重感染會(huì)引起患者死亡。豬鏈球菌的血清型較多，那樣還具有較強(qiáng)的地域性和時(shí)間性，不同地區(qū)分離株耐藥譜不一致，即使同一地區(qū)的不同菌種也有明顯的差異，所以不同豬場(chǎng)的豬鏈球菌分離株的耐藥性也不同。同時(shí)豬場(chǎng)對(duì)抗生素的濫用，不僅導(dǎo)致治療成本的增加，而且耽誤了最佳的治療時(shí)間，是豬鏈菌病能得以不斷發(fā)生和流行，更重要的是，是豬鏈球菌等耐藥譜越來(lái)越廣，耐藥性也越來(lái)越強(qiáng)。深入對(duì)豬鏈球菌毒力因子的研究，和對(duì)豬鏈球菌發(fā)病機(jī)制的研究，流行病學(xué)和病原學(xué)特性，將為保護(hù)效價(jià)高的新型基因工程疫苗和有效藥物的研制提供理論依據(jù)，也對(duì)進(jìn)一步的語(yǔ)法和檢測(cè)，有效控制傳染源和傳播途徑，具有重要的意義。同時(shí)運(yùn)用多種分子技術(shù)綜合客觀的檢測(cè)和鑒定非典型的病原及其毒力，才能夠真正的揭示病原的本質(zhì)。

【參考文獻(xiàn)】：

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