超聲輔助酶解制備澳洲堅果蛋白肽及其抗氧化活性的研究

帥希祥 杜麗清 張明 涂行浩

摘 要 以冷榨澳洲堅果粕為原料，通過堿提酸沉法得到澳洲堅果蛋白，采用超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白制備蛋白肽；以水解度為指標，利用單因素試驗與正交試驗考察各因素對超聲輔助酶解的澳洲堅果蛋白水解度的影響，同時采用ABTS自由基清除能力評價制備的澳洲堅果蛋白酶解液的抗氧化活性。結果表明：各因素對超聲輔助酶解的澳洲堅果蛋白水解度的影響次序為：酶添加量>酶解時間>酶解初始pH值>超聲功率，其最佳超聲輔助酶解條件為酶解時間120 min、加酶量5.0%、超聲功率300 W、酶解初始pH值10.0，在此條件下澳洲堅果蛋白的水解度為22.90%，其6.0%的酶解液清除ABTS自由基的能力達92.59%。說明超聲輔助酶解制備的澳洲堅果蛋白酶解液具有較強的抗氧化活性，可將其作為一種具有抗氧化作用的食品添加劑應用于食品工業。

關鍵詞 超聲波；酶解；澳洲堅果蛋白肽；抗氧化活性

中圖分類號 Q949.739 文獻標識碼 A

Abstract With macadamia pulp as raw material， the protein of macadamia nut through alkali extraction and acid precipitation， study on the technology of macadamia nut peptide prepared by ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis. The effects of four processing conditions on the degree of hydrolysis were explored by single factor and orthogonal array design methods in order to optimize these conditions. Meanwhile， the antioxidant activity of macadamia nut peptide was evaluated by ABTS scavenging activity. Results showed that the order of the factors was as follows： enzyme dosage>hydrolysis duration>pH>ultrasonic power， the optimized macadamia nut peptide hydrolysis parameters by ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis was： hydrolysis at 300 W for 120 min with enzyme dosage 5.0%， hydrolysis buffer pH10.0. The hydrolysis degree of macadamia nut protein was 22.90%， with 92.59% of the ABTS scavenging activity， it had strong antioxidant activity by ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis. It as a food additive has antioxidant properties， applied to food or health food industry.

Key words Ultrasonic wave； enzymatic hydrolysis； macadamia nut peptide； antioxidant activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.014

澳洲堅果（Macadamia ternifolia F. Muell.）別名澳洲核桃、夏威夷果等，屬山龍眼科澳洲堅果屬多年生常綠喬木[1-3]。20世紀60～70年代開始引入中國，目前在中國廣東、廣西、云南及貴州等地均有種植[4]。隨著澳洲堅果果樹的大量栽種，資源越來越豐富，澳洲堅果產業已具備一定規模，但澳洲堅果的深加工產業比較滯后，目前主要用于榨油，榨油后會產生大量的澳洲堅果餅粕，其含有較高含量的蛋白質（32.25%），且含有17種氨基酸，總含量為25.05%[5]。科學研究發現，蛋白質經適當的蛋白酶水解可獲得許多具有生物功能的生物活性肽，其易消化吸收，同時具有抗氧化、降血壓、降血脂、免疫調節等功能[6-8]。目前國內關于生物酶法制備澳洲堅果蛋白肽的研究已有一些報道[1，5]，但關于采用超聲輔助酶解制備澳洲堅果蛋白肽及其抗氧化活性的研究較少。超聲波產生的空化效應和機械效應對物質的提取、酶解反應及高分子的降解等具有一定的促進作用，在超聲作用下進行酶解反應可以縮短酶解時間、提高酶解效率、增加產物得率[9-10]。

本研究以澳洲堅果粕為原料，通過堿提酸沉法得到澳洲堅果蛋白；以水解度為指標，探討超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白的工藝優化，同時，采用2，2′-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基清除能力評價澳洲堅果蛋白酶解液的抗氧化活性，為澳洲堅果蛋白資源的精深加工及綜合利用提供可靠的理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 堅果來源 澳洲堅果餅粕由中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所休閑加工廠提供。

1.1.2 試劑 堿性蛋白酶（活力≥4 000 U/mg）、絲氨酸（99.99%）、ABTS（≥97%）、維生素C（阿拉丁化學試劑有限公司）；十水四硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉、二硫蘇糖醇、2，6-二叔丁基對甲酚、氫氧化鈉、鹽酸、過硫酸鉀、無水乙醇均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.1.3 儀器與設備 主要實驗儀器與設備如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 采用堿提酸沉法，工藝流程為：稱取100 g澳洲堅果餅粕放入濾紙包中，用沸點在30～60 ℃的石油醚進行索氏提取（6 h）；取出晾干，按1 ∶ 50（w ∶ V）加入蒸餾水，用1.0 mol/L NaOH調pH至9.0，于45 ℃水浴磁力攪拌2 h；以4 800 r/min離心過濾10 min，將上清液pH調至4.5，于4 ℃冰箱冷藏過夜；離心，水洗3次，冷凍干燥48 h，得到澳洲堅果粗蛋白，通過測定得知其蛋白質含量為84.6%。

1.2.2 超聲輔助酶解所得澳洲堅果蛋白酶解液中蛋白肽含量的測定 超聲輔助酶解所得澳洲堅果蛋白酶解液中蛋白肽的含量參照Pedroche等[11]和Nielsen等[12]報道的o-鄰苯二甲醛法（OPA）進行測定。

標準曲線的繪制：準確稱取0.100 0 g絲氨酸標準品，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，得到1.0 mg/mL的絲氨酸標準溶液；采用逐級稀釋來配置濃度分別為500、400、300、200、100、50、20、10、5 μg/mL的絲氨酸標準使用液；分別取100 μL絲氨酸標準使用液，加入4.00 mL OPA試劑（稱取3.81 g十水四硼酸鈉、100 mg SDS、8 mg OPA、88 mg二硫蘇糖醇，用蒸餾水溶解并定容至100 mL），充分混勻，在室溫下放置5 min，在340 nm下測定吸光值。

超聲輔助酶解所得澳洲堅果蛋白酶解液中蛋白肽含量的測定：取超聲輔助酶解所得的澳洲堅果蛋白酶解液100 μL，按上述操作測定。對照組：將澳洲堅果蛋白用強酸充分水解[13]后，用上述操作測定其蛋白肽含量。超聲輔助酶解的澳洲堅果蛋白水解度按下列公式計算：

式中：DH-超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白水解度，%；A-超聲輔助酶解的澳洲堅果蛋白酶解液中蛋白肽含量，μg/g；B-充分水解的澳洲堅果蛋白中蛋白肽的含量，μg/g。

1.2.3 超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白制備蛋白肽單因素試驗

（1）酶解時間對超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白水解度的影響。稱取5.000 g澳洲堅果蛋白溶解到100 mL蒸餾水中，用1.0 mol/L NaOH調節溶液pH值為8.0，加入4.0%的堿性蛋白酶，選超聲功率為300 W，在50 ℃條件下恒溫超聲酶解不同時間，測定不同酶解時間（0、10、30、60、80、100、120、160 min）對超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白水解度的影響。

（2）超聲功率對超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白水解度的影響。稱取5.000 g澳洲堅果蛋白溶解到100 mL蒸餾水中，用1.0 mol/L NaOH調節溶液pH值為8.0，加入4.0%的堿性蛋白酶，在不同超聲功率條件下以50 ℃恒溫酶解120 min，測定不同超聲功率（0、100、200、300、400、500 W）對超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白水解度的影響。

（3）加酶量對超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白水解度的影響。稱取5.000 g澳洲堅果蛋白溶解到100 mL蒸餾水中，用1.0 mol/L NaOH調節溶液pH值為8.0，加入不同量的堿性蛋白酶，超聲功率為400 W，在50 ℃條件下恒溫酶解120 min，測定不同堿性蛋白酶添加量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）對超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白水解度的影響。

（4）酶解初始pH值對超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白水解度的影響。稱取5.000 g澳洲堅果蛋白溶解到100 mL蒸餾水中，用1.0 mol/L NaOH分別調節溶液pH值為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，加入4.0%的堿性蛋白酶，超聲功率為400 W，在50 ℃條件下恒溫酶解120 min，測定不同pH值對超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白水解度的影響。

1.2.4 超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白制備蛋白肽正交試驗 在超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白制備蛋白肽單因素試驗的基礎上，分別選用超聲酶解時間（A）、加酶量（B）、超聲功率（C）、酶解初始pH值（D）4個因素，每個因素選擇3個水平，以水解度為指標，選用L9（34）進行正交設計來優化最佳超聲輔助酶解工藝條件。

1.2.5 超聲輔助酶解所得澳洲堅果蛋白酶解液抗氧化活性的測定 ABTS自由基溶液的配制和抗氧化活性測定參照李瑞等[14]的方法，并作略微修改。

樣品測定：取0.20 mL稀釋后的澳洲堅果蛋白酶解液（優化條件），加入4.00 mL ABTS自由基工作液，室溫下靜置反應5 min，在734 nm下測定其吸光值，用無水乙醇調零，以蒸餾水作為空白對照組。按下列公式計算其清除率：

式中：SA-ABTS自由基清除率，%；A-超聲輔助酶解所得澳洲堅果蛋白酶解液清除ABTS自由基的吸光值；Ao-對照組清除ABTS自由基的吸光值。

1.3 統計分析

采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行分析，結果均表示為均值±標準偏差，采用origin 8.0軟件作圖，所有結果均進行3次重復試驗。

2 結果與分析

2.1 酶解時間對超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白水解度的影響

通過絲氨酸標準曲線的繪制，得出其線性回歸方程為y=0.001 49x+0.000 01（x為絲氨酸含量ug/mL，y為吸光度，R2=0.999 9）。由圖1可以看出，隨著超聲輔助酶解時間的增加，澳洲堅果蛋白的水解度逐漸增加，在120 min達到最大值，之后趨于平緩。這可能是由于經過超聲輔助酶解，使澳洲堅果蛋白的長鏈斷開，結構變得松散，且堿性蛋白酶活性高，酶解產物的抑制作用小，從而在較短的時間內使其水解度有所提高；而120 min后隨著超聲輔助酶解時間的增加，酶解液中蛋白肽和游離氨基酸含量逐漸增加，其產生的抑制作用增大，堿性蛋白酶的活性因受到抑制而降低，且超過一定時間，超聲波的機械和空穴等作用可能使澳洲堅果蛋白和酶的結合位點逐漸破壞，從而影響它們的酶解作用，使其水解度增加的趨勢趨于平緩[15]，這與李楊等[16]利用超聲輔助酶解制備紅豆蛋白多肽、吳進菊等[15]利用超聲輔助酶解法制備大豆蛋白抗氧化肽所得結果一致，即隨著超聲時間的增加，多肽或抗氧化鈦水解度呈先升高后趨于平緩的變化趨勢。綜合各方面因素考慮，超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白的適宜時間為120 min左右，在此條件下澳洲堅果蛋白的水解度為20.08%。

2.2 超聲功率對超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白水解度的影響

由圖2可以看出，隨著超聲功率的增加，澳洲堅果蛋白的水解度呈先增加后降低的趨勢。當超聲功率為400 W時，蛋白質水解度達到最大（17.99%），繼續增加超聲功率，蛋白質水解度反而有所降低。這可能是因為超聲作用會使蛋白質的酶作用位點更多地暴露出來，促進酶與蛋白質的酶解作用，導致蛋白質的水解度增加；當超聲功率過大時，超聲波產生的空化作用和熱作用會破壞酶分子構象，使酶的活性降低甚至失活，從而導致蛋白質的水解度降低[15-17]。因此，超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白的最適超聲功率為400 W左右，在此條件下水解度達17.99%。

2.3 酶添加量對超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白水解度的影響

由圖3可以看出，隨著堿性蛋白酶加酶量的增加，超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白的水解度逐漸增加，但水解度的增加幅度逐漸減小，當酶添加量增加到4.0%時，蛋白水解度達到16.75%；繼續增加酶添加量，蛋白水解度增加不顯著。這可能是由于隨著堿性蛋白酶添加量的增加，增大了底物與酶的接觸面積，從而增大了酶催化反應的速率，所以水解度增加較快；當堿性蛋白酶添加量達到最適值時，大部分蛋白質幾乎達到了水解平衡，繼續加大酶的添加量將不會對蛋白質的水解產生明顯的效果[16]。因此，超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白的最適加酶量為4.0%左右，在此條件下水解度達到16.75%。

2.4 酶解初始pH對超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白水解度的影響

由圖4可以看出，隨著酶解初始pH值的增加，超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白的水解度逐漸增加，當酶解初始pH值增加到10.0時，蛋白水解度達到最大（17.04%）；繼續增加酶解初始pH值，其水解度反而降低。這可能是由于澳洲堅果蛋白在pH6.0時溶解度較低，底物與酶接觸不充分，而且蛋白酶都具有最適的pH值范圍，只有在最適的pH值范圍內才能發揮最好的酶解效果[18]。過高或過低的pH值均會導致酶空間結構的破壞，使酶活性降低，甚至失活，不利于酶解反應，導致其水解度降低[16]。而在pH8.0、9.0、10.0時，底物與酶接觸比較充分，澳洲堅果蛋白的溶解度較大，水解度增加。因此，超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白的適宜pH值為9.0左右，在此條件下的水解度達到17.04%。

2.5 超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白制備蛋白肽正交試驗分析

根據以上單因素實驗，以水解度為指標，選擇酶解時間（A）、加酶量（B）、超聲功率（C）和酶解初始pH值（D）4個因素進行L9（34）正交優化設計，確定超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白制備蛋白肽的最優工藝條件，正交試驗設計見表2，正交試驗結果見表3。

由表3可知，超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白制備蛋白肽的工藝中各因素對蛋白水解度的影響次序為：酶添加量>酶解時間>酶解初始pH值>超聲功率，酶添加量對其影響最為顯著。最優的工藝條件為A3B3C1D3，即酶解時間120 min、加酶量5.0%、超聲功率300 W、酶解液pH值10.0，在此條件下進行了3組平行驗證試驗，其水解度平均值為22.90%，優于正交試驗的結果，并且該結果與郭剛軍等[5]利用堿性蛋白酶和中性蛋白酶酶解澳洲堅果粕蛋白制備的多肽水解度（22.83%和22.78%）相當，但其酶解時間為3.5 h。本研究方法明顯縮短了酶解時間，說明超聲輔助酶解更適宜澳洲堅果蛋白肽的制備。

2.6 超聲輔助酶解所得澳洲堅果蛋白酶解液的抗氧化活性分析

清除ABTS自由基的能力可用來評價物質的抗氧化活性[19]。蛋白質通過酶解形成的多肽具有一定的抗氧化能力，對ABTS自由基等具有一定的清除能力[20]。圖5顯示了不同濃度的超聲輔助酶解所得澳洲堅果蛋白酶解液以及100 μg/mL Vc和100 μg/mL BHT對ABTS自由基的清除能力。從圖中可以看出，不同濃度澳洲堅果蛋白酶解液對ABTS自由基都有很強的清除能力，0.375%的澳洲堅果蛋白酶解液對ABTS自由基的清除能力為22.57%，且隨著澳洲堅果蛋白酶解液濃度的增加，其清除能力也增強，6.0%澳洲堅果蛋白酶解液對ABTS自由基的清除能力達到92.59%，而100 μg/mL Vc和100 μg/mL BHT對ABTS自由基的清除能力分別僅為68.12%和66.17%。同時，范方宇等[1]研究堿性蛋白酶酶解澳洲堅果蛋白所得酶解液的抗氧化活性，發現其清除羥基自由基和超氧自由基能力都較強。因此，超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白制備的蛋白肽具有較強的抗氧化活性，可作為一種具有抗氧化作用的食品添加劑應用于食品工業。

3 結論

本研究采用超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白制備蛋白肽，并對其酶解液抗氧化活性進行評價。通過正交和驗證試驗發現其最優酶解條件為：酶解時間120 min、加酶量5.0%、超聲功率300 W、酶解液pH值10.0，且各因素對超聲輔助酶解澳洲堅果蛋白水解度的影響次序為：酶添加量>酶解時間>酶解初始pH值>超聲功率，在此條件下所得澳洲堅果蛋白的水解度為22.90%，其6.0%的酶解液清除ABTS自由基的能力達92.59%，說明超聲輔助酶解制備的澳洲堅果蛋白肽具有較強的抗氧化活性，可作為一種具有抗氧化作用的食品添加劑應用于食品工業。且本研究方法與郭剛軍等[5]研究相比，明顯縮短了酶解時間，但目前對于酶解液中蛋白肽的氨基酸組成、蛋白肽分子結構及其構效關系等都還未開展相關研究，后續將對這些方面進行深入研究，以期為澳洲堅果蛋白肽的開發和應用提供科學的理論基礎。

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