響應面法優化藍藻溶藻菌CZBC1發酵培養工藝

胡曉娟 徐創文 李卓佳 文國棵 楊鏗 許云娜 李莎莎 曹煜成

摘要：[目的]優化藍藻溶藻菌——蠟樣芽孢桿菌CZBC1的發酵培養工藝，為藍藻溶藻菌制劑的工業化發酵生產提供技術支持。[方法]通過單因素試驗篩選適合蠟樣芽孢桿菌CZBC1生長的最適碳源和氮源，在單因素試驗的基礎上，采用中心組合試驗設計（CCD）確定關鍵因子的最佳數量水平，并以Desig-Expert8.0.5進行回歸分析，通過響應面分析獲得CZBC1的最佳發酵培養工藝參數。[結果]蠟樣芽孢桿菌CZBC1的最佳碳源、氮源分別為麩皮+糖蜜（1：1）和酵母膏。以麩皮+糖蜜用量（A）、酵母膏用量（B）、pH（C）、培養時間（D）為因素變量，CZBC1芽孢數（1gN）為響應值，擬合得到二次多元回歸方程為1gN=8.5019-0.2222A+0.0998B-0.1292C+0.3801D+0.2194AB-0.1133AC+0.1350AD+0.2049BC-0.0651BD+0.0638CD-0.1260A²-0.3152B²-0.0380C²-0.2533D²，其中，碳源（麩皮+糖蜜）用量與氮源（酵母膏）用量的交互作用、碳源用量與pH的交互作用、碳源用量與培養時間的交互作用、氮源用量與pH的交互作用對CZBCl芽孢數的影響均達極顯著水平（P<0.01，下同）。響應面分析優化得到的蠟樣芽孢桿菌CZBC1最佳發酵培養參數：麩皮+糖蜜6.84g/L，酵母膏3.36g/L，pH6.50，培養時間42h。此條件下，CZBC1芽孢數的實際值為5.75×10⁸CFU/mL，與理論值（5.90×10⁸CFU/mL）間無顯著差異（P>0.05），但極顯著高于優化前采用營養肉湯發酵培養的芽孢數（1.28×10⁷CFU/mL）。[結論]采用響應面法優化得出蠟樣芽孢桿菌CZBC1最佳發酵培養工藝能有效提高菌株的芽孢數量，且模型擬合效果較好，可用于指導藍藻溶藻菌制劑的工業化發酵生產。

關鍵詞：藍藻；溶藻菌；芽孢；培養參數；響應面分析

中圖分類號：S917.3 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）11-2092-08

0引言

[研究意義]養殖水體富營養化日益加劇，藍藻水華頻繁暴發對水體生態環境和養殖效益造成巨大影響（Caoet a1.，2014），如何有效防控有害藍藻暴發已成為當前水產養殖業的研究熱點之一（李茂兵等，2016）。目前，生產上主要使用化學藥品防控有害藻類，但其殺藻專一性差，不利于養殖水體優良菌藻環境的養護，且易造成藥物殘留，影響水產品質量安全（郗建云等，2016）。溶藻菌（Algae-lvsingbacteria）可通過直接接觸或釋放某些特異或非特異性的胞外物質溶解藻類細胞，還能通過競爭氮磷營養鹽來抑制微藻生長，從而達到控藻的效果（陳慶麗等，2015）。可見，溶藻菌制劑的研發及推廣應用為有效防控養殖水體有害藍藻暴發提供了新思路。[前人研究進展]黏細菌（Myxcobacteria）是最早被報道的溶藻菌（吳剛等，2002），其與藍藻接觸后能導致藍藻的營養細胞溶解，但對靜息孢子不產生影響。間接溶藻是溶藻菌作用的主要方式，通過釋放特異性或非特異性的胞外物質，如蛋白質、羥胺、抗生素、多肽等殺死藻類細胞，常見的溶藻菌有弧菌、假單胞菌、黃桿菌、交替單胞菌和交替假單胞菌等（王麗花等，2012）。黃姿等（2008）從海南洋浦港沉積物中分離出一株具有較強溶藻活性的細菌，經形態和生理測試及16SrDNA序列分析，初步鑒定為交替假單胞菌（Pseudoalteromonassp.）。顏小丹（2011）從湛江市海濱公園土樣中篩選分離出一株溶藻菌，初步鑒定為側孢短芽孢桿菌（Brevibacilluslaterosporus），該溶藻菌在黑暗條件下對顫藻（Oscillatoriaplanctoni-ca）和席藻（Phormidumlucidum）的生長抑制效果最佳。曹煜成等（2014）篩選獲得一株養殖池塘藍藻溶藻菌——蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）CZBC1，并證實該菌株具有廣溫、廣鹽、耐高pH和低耗氧的特性，可通過直接或間接的方式溶解浮游顫藻、綠色顫藻（O.chlorine）和小顫藻（O.tenuis）等有害藍藻（王麗花等，2012；王善龍等，2016），但對養殖對蝦無不良影響。溶藻菌相對濃度是影響溶藻效果的關鍵因素，其濃度越高，溶藻效果越明顯（張俊等，2010；Yangeta1.，2013）。此外，發酵培養工藝決定了菌劑產品的菌體濃度及品質（BehelandJackson，2014）。唐艷斌等（2013）、Mazzucotelli等（2016）利用響應面分析法分別對枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）的培養工藝進行優化，均有效提高了菌劑產量。[本研究切入點]至今，有關藍藻溶藻菌的研究主要集中于菌株分離篩選及其溶藻作用機理（Tianeta1.，2012；Jiangeta1.，2014），而鮮見利用響應面分析法優化藍藻溶藻菌發酵培養工藝的相關報道。[擬解決的關鍵問題]采用響應面分析法對藍藻溶藻菌——蠟樣芽孢桿菌CZBC1的發酵培養工藝進行優化，以期提高菌體有效菌濃度，為藍藻溶藻菌制劑的工業化發酵生產提供技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

蠟樣芽孢桿菌CZBCl由中國水產科學研究院南海水產研究所對蝦健康養殖實驗室分離提供，該菌種已在中國典型培養物保藏中心保藏（保藏編號為CCTCCNo：M2013130），并獲國家發明專利授權（曹煜成等，2014）。營養肉湯培養基：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏3.0g/L，NaCl5.0g/L，pH7.0-7.5。發酵基礎培養基：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨3.0g/L，NaCl1.0g/L，KH₂PO₄0.2g/L，MgSO₄0.2g/L，FeCl₃0.1g/L，3.08%MnSO₄1.0mL/L，CaCO₃0.1g/L，pH7.5-8.0。

1.2試驗方法

1.2.1單因素試驗 保藏的蠟樣芽孢桿菌CZBCl以營養肉湯培養基活化，在發酵基礎培養基基礎上，選取不同的碳源[葡萄糖、蔗糖、葡萄糖+蔗糖（1：1）、可溶性淀粉、糖蜜、玉米漿、玉米淀粉、麩皮、麩皮+糖蜜（1：1）、可溶性淀粉+玉米漿（1：1）]和氮源[蛋白胨、酵母膏、蛋白胨+酵母膏（1：1）、硫酸銨、豆粕、大豆蛋白、豆粕+大豆蛋白+酵母膏（1：1：1）]，其他成分不變，初始接種濃度×10⁴CFU/mL，30℃下搖床振蕩（200r/min）培養，分別于發酵培養24和48h后檢測芽孢數。

1.2.2中心組合試驗設計（Centralcompositede-sign，CCD） 在單因素試驗的基礎上，選擇4個條件（碳源用量、氮源用量、pH和培養時間）作為因素，每個因素

1.2.3響應面分析 以芽孢數（1gN）為響應值，對CCD試驗結果進行多元回歸分析，擬合回歸方程；并根據回歸方程，利用Design-Expert8.0.5繪制響應面分析圖進行響應面分析。

1.2.4響應面驗證試驗 對響應面分析優化確定的培養基組成、發酵條件及預測芽孢數進行搖瓶驗證試驗，檢驗回歸方程的有效性。

1.3統計分析

采用Design-Expert8.0.5對CCD試驗結果進行多元回歸分析和響應面分析，并以SPSS19.0檢驗不同碳源和氮源對CZBCl芽孢數影響的差異顯著性。

2結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1不同碳源對蠟樣芽孢桿菌CZBCl芽孢數的影響 在基礎發酵培養基的基礎上，以不同碳源代替基礎發酵培養基中的葡萄糖，其他成分不變，發酵培養后所得的芽孢數存在明顯差異（圖1）。以麩皮+糖蜜作為碳源，在發酵培養24和48h后的芽孢數可達3.58×10⁸和2.93×10⁸CFU/mL，顯著高于其他處理組（P<0.05，下同）；采用營養肉湯發酵培養24和48h后的芽孢數僅為5.58×10⁶和1.28×10⁷CFU/mL。因此，選取麩皮+糖蜜作為CZBC1發酵培養基的碳源。

2.1.2不同氮源對蠟樣芽孢桿菌CZBCl芽孢數的影響 在基礎發酵培養基的基礎上，以不同氮源代替基礎發酵培養基中的蛋白胨，其他成分不變，發酵培養后所得的芽孢數也存在一定差異（圖2）。以酵母膏作為氮源，在發酵培養24和48h后的芽孢數可達3.60×10⁸和1.72×10⁸CFU/mL，尤其是發酵培養24h的芽孢數顯著高于其他處理組。因此，選取酵母膏作為CZBC1發酵培養基的氮源。

2.2響應面法優化結果

2.2.1CCD試驗結果 通過CCD設計的麩皮+糖蜜用量、酵母膏用量、pH和培養時間4因素5水平試驗，得到30組發酵培養蠟樣芽孢桿菌CZBCl的芽孢數據，其中芽孢數（1gN）最高值為8.60、最低為6.01（表2）。

2.2.2二次回歸擬合及方差分析結果 以芽孢數（1gN）為響應值，利用Design-Expert8.0.5對表2進行多元回歸分析，得到二次回歸方程：

由表3可知，回歸系數模型P<0.0001，說明二次回歸模型顯著；失擬性的P=-0.0666，說明該模型失擬不顯著（P>0.05，下同）；相關系數R²=0.9777，說明二次回歸模型能較好地反映響應值變化，即模型與實際試驗擬合程度較好，預測值與實際值問具有較高的相關性，可用于蠟樣芽孢桿菌CZBCl發酵培養的理論預測。

由表3還可看出，碳源（麩皮+糖蜜）用量、氮源（酵母膏）用量、培養時間的一次項和二次項、pH的一次項、碳源用量與氮源用量的交互作用、碳源用量與pH的交互作用、碳源用量與培養時間的交互作用、氮源用量與pH的交互作用對蠟樣芽孢桿菌CZBCl芽孢數的影響均達極顯著水平（P<0.01，下同）。各因素對蠟樣芽孢桿菌CZBCl芽孢數的影響順序為：D>B²>D²>A>AB>BC>A²>C>AD>B>AC。

2.2.3各因素間的交互作用 在響應曲面圖中，曲面開口向下表示響應值存在極大值，曲面開口向上則表示響應值存在極小值；在等高線圖中，等高線呈圓形表示因素問的交互作用對響應值影響不顯著，等高線呈橢圓形則表示因素問的交互作用對響應值影響顯著（韓建軍等，2015；吳存兵等，2016；BhattacharieeandJoshi，2016）。圖3反映麩皮+糖蜜用量與酵母膏用量對CZBC1芽孢的影響，其響應曲面圖曲線陡、等高線呈橢圓形，即麩皮+糖蜜用量與酵母膏用量的交互效應顯著。圖4反映麩皮+糖蜜用量與pH對CZBC1芽孢數的影響，其響應曲面圖曲線陡、等高線呈橢圓形，即麩皮+糖蜜用量與酵母膏用量的交互效應顯著。圖5反映麩皮+糖蜜用量與培養時間對CZBC1芽孢數的影響，其響應曲面圖曲線陡、等高線呈橢圓形，即麩皮+糖蜜用量與培養時間的交互效應顯著。圖6反映酵母膏用量與pH對CZBC1芽孢數的影響，其響應曲面圖曲線陡、等高線呈橢圓形，即酵母膏用量與pH的交互效應顯著。

2.3響應面優化驗證試驗結果

經DesignExpert8.0.5分析得出蠟樣芽孢桿菌CZBCl的最佳發酵培養參數為：麩皮+糖蜜6.84g/L，酵母膏3.36g/L，pH6.50，發酵培養時間42h。在此條件下，CZBCl的理論芽孢數為5.90×10⁸CFU/mL。發酵培養驗證試驗結果顯示，在最佳發酵培養條件下培養菌株CZBC1，其芽孢數實際值為5.75×10⁸CFU/mL，與理論值問無顯著差異，但極顯著高于優化前采用營養肉湯發酵培養的芽孢數（1.28×10⁷CFU/mL）。表明擬合得到的二次回歸方程模型預測準確，可用于指導藍藻溶藻菌CZBC1的發酵生產。

3討論

從目前已報道的溶藻菌種類來看，芽孢桿菌（Bacillussp.）為常見的溶藻菌之一。彭超等（2003）從武漢市某養殖池塘分離獲得3株能溶解藍藻的溶藻菌，經鑒定其中1株屬于芽孢桿菌屬。Li等（2015）分離獲得可溶解銅綠微囊藻（Microcystisaerugino-sa）的菌株Lzh-5也隸屬于芽孢桿菌屬，且證實其濃度與微藻活性呈正相關。芽孢桿菌可產生耐高溫的芽孢，既容易存活和繁殖，又適用于生產和劑型加工（王星云等，2007）。因此，在芽孢桿菌的多級發酵過程中，應重點關注芽孢的數量，并通過優化發酵培養工藝、有效提高菌株濃度以保證溶藻效果。

碳源既能為微生物的生長提供原材料，又能為其提供生長所需的能量，是微生物必需的基礎營養物質；氮源能為微生物合成蛋白質、核酸及其他氮素化合物提供原材料（趙能等，2016）。微生物間通常存在種屬特異性，因不同種菌株生長代謝所產生的酶種類及活性不同，造成其對碳、氮的吸收利用也存在一定選擇性（宋瑛瑛等，2016）。因此，篩選適合芽孢桿菌生長的最佳碳、氮源可有效提高其芽孢產量。目前，常用的碳源主要有葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉等速效碳源，常用的氮源主要有酵母膏和蛋白胨等有機氮源。本研究通過單因素試驗對蠟樣芽孢桿菌CZBC1生長過程中的碳源和氮源進行篩選優化，結果表明，CZBC1對有機碳源麩皮+糖蜜及有機氮源酵母膏有很好的利用效果，發酵培養24h后其芽孢數分別達5.58×10⁸和4.70×10⁸CFU/mL。碳源麩皮和糖蜜均為飼料級廉價易得的天然有機物，其中麩皮是小麥加工副產物，糖蜜是甘蔗加工副產物。相對于葡萄糖和蔗糖等速效碳源而言，麩皮和糖蜜的成分較復雜，不僅含有豐富的碳源，還含有較多的營養因子和無機元素，是工業化發酵生產中常用的碳源（曹香林和陳建軍，2014；何海燕，2016）。氮源酵母膏是由新鮮酵母乳液經酶解、分離、濃縮得到的純天然制品，不僅能促進細胞生長，還有利于細胞生成代謝產物（許翠等，2015）。

pH是影響芽孢產量的又一重要因素。一方面，pH變化會影響細胞膜電荷，影響營養物質和代謝產物的解離，進而影響微生物對營養物質的利用效果（陳令等，2014）；另一方面，pH變化可對芽孢活性產生影響（劉楓等，2013）。培養時間則是影響芽孢生產率的關鍵因素。為此，本研究對碳源、氮源、pH和培養時間4個因素的參數值進行響應面優化分析，最終確定CZBCl的最佳培養參數為：麩皮+糖蜜6.84g/L，酵母膏3.36g/L，pH6.50，培養時間42h。在最佳發酵培養條件下，CZBCl的芽孢數實際值為5.75×10⁸CFU/mL，極顯著高于優化前采用營養肉湯發酵培養的芽孢數（1.28×10⁷CFU/mL）。說明響應面法優化得出蠟樣芽孢桿菌CZBC1最佳發酵培養工藝能有效提高菌株的芽孢數量，可為工業化生產藍藻溶藻菌制劑提供技術支持。

4結論

采用響應面法優化得出蠟樣芽孢桿菌CZBC1最佳發酵培養工藝能有效提高菌株的芽孢數量，且模型擬合效果較好，可用于指導藍藻溶藻菌制劑的工業化發酵生產。

（責任編輯蘭宗寶）