濃縮型獸用雙黃連口服液的急性毒性及亞慢性毒性試驗(yàn)

吳苑瀅　宋漫玲　谷俐嬡　楊劍　韋英益　胡庭俊

摘要：[目的]評(píng)價(jià)濃縮型獸用雙黃連口服液的用藥安全性，為其臨床用藥提供參考依據(jù)。[方法]以昆明系小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)開(kāi)展?jié)饪s型獸用雙黃連口服液的急性毒性及亞慢性毒性試驗(yàn)，確定其臨床應(yīng)用的主要毒性作用及毒性作用靶器官。其中，急性毒性試驗(yàn)設(shè)20.00、10.00、5.00、2.50和1.25g/kg5個(gè)劑量組，試驗(yàn)開(kāi)始當(dāng)天在24h內(nèi)分2-3次對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃給藥；最大耐受量試驗(yàn)用藥劑量為240.00g/kg，試驗(yàn)開(kāi)始當(dāng)天在24h內(nèi)分2次對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃給藥，每次0.80mL/只；亞慢性毒性試驗(yàn)設(shè)每天灌服0.16、0.08和0.04mL/只3個(gè)劑量組，連續(xù)灌胃給藥28d。[結(jié)果]急性毒性試驗(yàn)小鼠灌胃給藥后30min內(nèi)精神萎靡，安靜，呼吸變慢，但30mind恢復(fù)正常，未出現(xiàn)中毒癥狀和死亡現(xiàn)象，未能測(cè)出半數(shù)致死量（LD₅₀）。小鼠對(duì)濃縮型獸用雙黃連口服液的最大耐受量大于240.00g/kg。亞慢性毒性試驗(yàn)期間，各用藥組小鼠的體重、臟器（肝臟、脾臟和。腎臟）指數(shù)和血清學(xué)指標(biāo)（谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮和肌酐含量）與空白對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異（P>0.05）；病理組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，僅高劑量組小鼠的肝臟有損傷，肝細(xì)胞有點(diǎn)狀壞死灶，肝細(xì)胞索凌亂，細(xì)胞界限模糊不清，細(xì)胞核著色減弱，其他臟器組織切片均無(wú)異常變化。[結(jié)論]濃縮型獸用雙黃連口服液對(duì)小鼠無(wú)急性毒性作用，長(zhǎng)期連續(xù)用藥也無(wú)亞慢性毒性作用，安全性較高。

關(guān)鍵詞：小鼠；濃縮型獸用雙黃連口服液；急性毒性；最大耐受量；亞慢性毒性

中圖分類(lèi)號(hào)：S853.74 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）11-2086-06

0引言

[研究意義]雙黃連是由金銀花、黃芩、連翹三味中藥精制而成的方劑，其主要功效是辛涼解表、清熱解毒（張志美等，2010；劉剛和趙華，2013）。《中國(guó)獸藥典》規(guī)定：雙黃連口服可用于治療貓、犬和雞等動(dòng)物的感冒發(fā)熱。現(xiàn)代藥理學(xué)也研究證實(shí)，雙黃連具有抗病毒、抗菌抗炎和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多重功效。目前市面上已有的獸用雙黃連制劑包括口服液、注射液、顆粒劑、散劑和粉劑等（楊海涵等，2009），但隨著雙黃連在獸醫(yī)臨床上的推廣應(yīng)用，上述制劑品種已無(wú)法滿(mǎn)足多樣化和個(gè)性化的臨床需求。因此，加強(qiáng)獸用雙黃連新劑型的研發(fā)對(duì)滿(mǎn)足各種臨床需求及促進(jìn)其推廣應(yīng)用具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]至今，有關(guān)雙黃連制劑在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用已有較多報(bào)道。汪勇等（2006）通過(guò)母畜子宮內(nèi)膜炎臨床治療試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)雙黃連注射液對(duì)家畜無(wú)毒副作用，且能增強(qiáng)家畜抵抗力，是治療母畜子宮內(nèi)膜炎的首選藥物。周翠珍等（2008）以不同劑量雙黃連可溶性粉劑對(duì)人工感染的雞傳染性支氣管炎進(jìn)行預(yù)防和治療，結(jié)果表明，雙黃連可溶性粉劑防治雞傳染性支氣管炎的效果顯著。徐海瑛等（2012）研究表明，雙黃連口服液和青霉素G聯(lián)用對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌濃度指數(shù)（FIC）為0.125，二者對(duì)金黃色葡萄球菌的聯(lián)合藥敏結(jié)果呈協(xié)同作用。趙增成等（2014）通過(guò)對(duì)比9種中藥方劑對(duì)雞大腸桿菌病的防治效果，發(fā)現(xiàn)雙黃連口服液無(wú)論在體外或體內(nèi)對(duì)大腸桿菌均具有一定的防治效果。關(guān)于雙黃連制劑的毒理學(xué)研究，解黎雯等（1999）研究表明，給小白鼠灌服雙黃連口服液的劑量達(dá)225g/kg時(shí)，小白鼠全部健康存活，且對(duì)體重、血液生化指標(biāo)和主要臟器系數(shù)均無(wú)顯著影響；周德剛等（2011）通過(guò)急性毒性試驗(yàn)證實(shí)，雙黃連口服液對(duì)小白鼠的最小致死量范圍為49.2～60.8g/b，相當(dāng)于禽類(lèi)臨床用量的111.8～138.2倍，即臨床應(yīng)用具有一定安全性；賀一新等（2017）研究證實(shí)，雙黃連口服液（僅適用于兒童）濃縮膏對(duì)幼年大鼠全身臟器和組織無(wú)相關(guān)毒性作用，安全性較好。[本研究切入點(diǎn)]濃縮型獸用雙黃連口服液是本課題組針對(duì)雞風(fēng)熱感冒研制而成，臨床用藥試驗(yàn)證實(shí)給藥后3～5d病雞精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)且咳嗽減少，給藥后11d病雞各方面逐漸恢復(fù)正常，治療效果明顯，但目前關(guān)于濃縮型獸用雙黃連口服液的毒理學(xué)研究尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題]通過(guò)開(kāi)展?jié)饪s型獸用雙黃連口服液的急性毒性及亞慢性毒性試驗(yàn)，確定其臨床應(yīng)用的主要毒性作用及毒性作用靶器官，并評(píng)價(jià)用藥安全性，為濃縮型獸用雙黃連口服液的臨床用藥提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

濃縮型獸用雙黃連口服液為河南牧翔動(dòng)物藥業(yè)有限公司的中試產(chǎn)品（100mL/瓶），生產(chǎn)批號(hào)20140208，規(guī)格3.0g/mL；谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；昆明系小鼠（15.00～22.00g/只）購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄各半。主要儀器設(shè)備有AidaTD-5A臺(tái)式低速離心機(jī)、CD-UPT-1純水儀、AB104-L分析天平（瑞士梅特勒）、ALPHARA-8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋和尼康YS100生物顯微鏡等。

1.2急性毒性試驗(yàn)

首先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，將20只小鼠隨機(jī)分成5組，每組4只，分籠飼養(yǎng)。濃縮型獸用雙黃連口服液設(shè)A（20.00g/kg）、B（10.00g/kg）、C（5.00g/kg）、D（2.50g/kg）和E（1.25g/kg）5個(gè)劑量組，于試驗(yàn)開(kāi)始當(dāng)天在24h內(nèi)分2～3次對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃給藥。連續(xù)觀察7d，詳細(xì)記錄小鼠的飲食、飲水變化及有無(wú)中毒或死亡現(xiàn)象出現(xiàn)。給藥第8d將全部供試小鼠頸椎脫臼處死，解剖觀察其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和腸道等器官有無(wú)異常變化。若預(yù)試驗(yàn)有小鼠死亡，則按死亡組給藥劑量估計(jì)死亡率靠近0和100%的劑量范圍，為急性毒性試驗(yàn)的正式試驗(yàn)提供依據(jù)。若預(yù)試驗(yàn)無(wú)小鼠死亡，則需進(jìn)行藥物的最大耐受量試驗(yàn)。采用寇氏法計(jì)算供試藥物的半數(shù)致死量（LD₅₀）及95%可信限范圍。

1.3最大耐受量試驗(yàn)

隨機(jī)挑選20只小鼠（小鼠給藥體重均按20.00g/只計(jì)），給藥劑量240.00g/kg，于試驗(yàn)開(kāi)始當(dāng)天在24h內(nèi)分2次對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃給藥，每次0.80mL/只。給藥后24h內(nèi)觀察小鼠是否發(fā)生中毒反應(yīng)，隨后每日觀察小鼠的飲食、精神狀態(tài)、自主活動(dòng)、糞便情況等1～2次，并做好記錄。連續(xù)觀察7d，試驗(yàn)期間保持各飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致。給藥第8d將全部供試小鼠頸椎脫臼處死，解剖觀察其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和腸道等器官有無(wú)異常變化。

1.4亞慢性毒性試驗(yàn)

將80只小鼠隨機(jī)分為4組，每組20只（雌雄各半），分籠飼養(yǎng)，每籠10只。根據(jù)急性毒性試驗(yàn)和最大耐受量試驗(yàn)結(jié)果分別設(shè)空白對(duì)照組及高劑量組（24.00g/kg）、中劑量組（12.00g/kg）和低劑量組（6.00g/kg）。高劑量組小鼠每天灌胃給藥0.16mL/只，中劑量組小鼠每天灌胃給藥0.08mL/只，低劑量組小鼠每天灌胃給藥0.04mL/只；空白對(duì)照組小鼠自由飲水。連續(xù)用藥28d。每日觀察小鼠的一般健康狀態(tài)，包含采食與飲水、活動(dòng)、發(fā)病及死亡情況等。第1次給藥前稱(chēng)重，此后每7d稱(chēng)重一次，共5次。第29路組小鼠稱(chēng)重、眼眶采血后頸椎脫臼處死，對(duì)處死小鼠進(jìn)行全面檢查，采集其肝臟、脾臟和腎臟稱(chēng)重并記錄，計(jì)算肝臟、脾臟和腎臟指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器重（mg）/體重（g）。經(jīng)小鼠眼眶采集的血液先進(jìn)行白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)（n=80），同時(shí)離心收集血清，-20℃保存或按相關(guān)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明測(cè)定小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮和肌酐含量。采集的肝臟、脾臟和腎臟稱(chēng)重后，以10%中性福爾馬林固定，用于制作組織切片。

1-.5統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進(jìn)行方差分析和多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

急性毒性試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，灌胃給藥后30min內(nèi)小鼠精神萎靡，安靜，呼吸變慢，30min后精神狀態(tài)恢復(fù)正常，可采食飲水；24h內(nèi)小鼠未出現(xiàn)中毒癥狀。連續(xù)觀察7d，所有小鼠的食欲、精神狀態(tài)及采食、飲水、排便等活動(dòng)正常，無(wú)中毒癥狀和死亡現(xiàn)象出現(xiàn)。經(jīng)剖檢觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、胃、腸道等主要臟器無(wú)異常變化。因無(wú)小鼠死亡，未能計(jì)算出濃縮型獸用雙黃連口服液的LD₅₀，而需進(jìn)行最大耐受量試驗(yàn)以檢驗(yàn)藥物安全性。

由表1可看出，灌服不同劑量濃縮型獸用雙黃連口服液后，小鼠的體重均有所增長(zhǎng)，但各劑量組間差異不顯著（P>0.05，下同）；各劑量組小鼠的平均增重范圍為4.57～6.19g/只，增重率為21.42%～29.01%，組間差異均不顯著。

2.2最大耐受量試驗(yàn)結(jié)果

在最大耐受量試驗(yàn)期間，小鼠也未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，灌胃給藥后30min內(nèi)小鼠精神萎靡，不愿動(dòng)，呼吸變慢，30min后精神狀態(tài)恢復(fù)正常，可采食飲水；24h內(nèi)小鼠未出現(xiàn)中毒癥狀。連續(xù)觀察7d，均無(wú)中毒癥狀和死亡現(xiàn)象出現(xiàn)，所有小鼠的食欲、精神狀態(tài)及采食、飲水、排便等活動(dòng)正常。給藥后第8d剖檢觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、胃、腸道等臟器均未出現(xiàn)任何肉眼可見(jiàn)的特征性病理變化。在體重增重方面，小鼠平均增重2.92g/只，增重率為13.45%。根據(jù)藥物毒理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判定，當(dāng)藥物L(fēng)D₅₀>5g/kg時(shí)，該藥物屬于實(shí)際無(wú)毒性物質(zhì)。本研究中，濃縮型獸用雙黃連口服液的最大耐受量試驗(yàn)口服劑量達(dá)240.00g/kg，小鼠仍健康存活，表明濃縮型獸用雙黃連口服液對(duì)小鼠的安全性很高。

2.3亞慢性毒性試驗(yàn)

2.3.1臨床表現(xiàn) 在亞慢性毒性試驗(yàn)期間，3個(gè)藥物劑量組小鼠活動(dòng)自如，排泄物無(wú)異常，正常飲食，未見(jiàn)異常行為，也未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。在體重增重方面，3個(gè)用藥組小鼠的體重變化趨勢(shì)與空白對(duì)照組基本一致，各處理組間均無(wú)顯著差異（圖1）。

2.3.2臟器指數(shù) 剖檢觀察發(fā)現(xiàn)，各處理組小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的形態(tài)、顏色、質(zhì)地均正常，無(wú)明顯的肉眼可見(jiàn)病變。中、高劑量組小鼠的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)略高于空白對(duì)照組（表2），但差異不顯著，說(shuō)明經(jīng)胃灌服濃縮型獸用雙黃連口服液不會(huì)導(dǎo)致小鼠實(shí)質(zhì)臟器損傷或異常變化。

2.3.3血清生化指標(biāo) 連續(xù)給藥28d后，小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮和肌酐含量隨給藥劑量的增加呈逐漸上升趨勢(shì)，但與空白對(duì)照組相比差異均不顯著（表3）；白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果也表明，高、中、低劑量組小鼠的白細(xì)胞數(shù)與空白對(duì)照組相比差異均不顯著。說(shuō)明經(jīng)胃灌服濃縮型獸用雙黃連口服液對(duì)小鼠的白細(xì)胞及肝臟、腎臟功能均未產(chǎn)生明顯影響。 2.3.4臟器組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 取各處理組小鼠的肝臟、脾臟和腎臟制作病理組織切片，經(jīng)HE染色后，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，高劑量組小鼠的肝臟有損傷，肝細(xì)胞有點(diǎn)狀壞死灶，肝細(xì)胞索凌亂，細(xì)胞界限模糊不清，細(xì)胞核著色減弱（圖2和圖3）；中、低劑量組小鼠的肝臟組織切片未見(jiàn)異常病理變化。各處理組小鼠腎臟組織切片中腎小管、腎小球輪廓清晰可辨，無(wú)顆粒變性或明顯的炎癥變化；脾臟組織切片中紅髓、白髓和脾小體清晰，也無(wú)明顯的病理變化。說(shuō)明長(zhǎng)期灌服濃縮型獸用雙黃連口服液的用藥劑量達(dá)24.00g/kg時(shí)，會(huì)影響小鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，即肝細(xì)胞受到一定程度的損傷。

3討論

雙黃連具有抗病毒、抗菌、抗炎癥、調(diào)節(jié)免疫等多重功效（程慧等，2011；劉剛和趙華，2013），尤其對(duì)乙型鏈球菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等有很強(qiáng)的殺菌或抑菌作用（楊海涵等，2009），在臨床上多用于治療呼吸、消化和泌尿系統(tǒng)疾病，且療效顯著（董文剛，2010）。本研究結(jié)果表明，經(jīng)胃灌服濃縮型獸用雙黃連口服液的小鼠生長(zhǎng)發(fā)育良好，無(wú)論是雌性還是雄性，其體重均能保持穩(wěn)定的增長(zhǎng)趨勢(shì)，與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差異；連續(xù)給藥28d后，小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的形態(tài)、顏色和質(zhì)地均正常，無(wú)明顯的肉眼可見(jiàn)病變，其肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)與空白對(duì)照組的差異也不顯著。血液白細(xì)胞數(shù)量增加通常見(jiàn)于感染、應(yīng)激（手術(shù)、創(chuàng)傷等）和急性慢性白血病等。本研究的亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，高、中、低劑量組小鼠的白細(xì)胞數(shù)與空白對(duì)照組相比差異不顯著，進(jìn)一步說(shuō)明濃縮型獸用雙黃連口服液對(duì)小鼠的安全性很高。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮和肌酐4項(xiàng)血清學(xué)生化指標(biāo)在獸醫(yī)毒理學(xué)研究中主要用于測(cè)定肝膽腎功能。谷丙轉(zhuǎn)氨酶又稱(chēng)谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶或丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，其含量升高可能預(yù)示著肝臟發(fā)生異常變化，如肝損傷和各類(lèi)肝炎等。本研究通過(guò)檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量能了解濃縮型獸用雙黃連口服液對(duì)小鼠肝臟的損傷情況。谷草轉(zhuǎn)氨酶也是預(yù)示肝功能異常的指標(biāo)，且與動(dòng)物體內(nèi)的蛋白代謝密切相關(guān)。當(dāng)機(jī)體肝臟損傷必然導(dǎo)致血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶上升（呂瓊霞等，2011）。肌酐分為血清肌酐和尿肌酐，是評(píng)價(jià)腎功能的主要指標(biāo)之一（李海霞等，2006）。血清肌酐含量較高時(shí)表明腎功能出現(xiàn)問(wèn)題，腎臟代謝能力降低，致使某些有害毒素?zé)o法正常排出體外。腎功能受損時(shí)常見(jiàn)尿素氮等指標(biāo)上升，因此尿素氮也是評(píng)價(jià)腎小球?yàn)V過(guò)的主要指標(biāo)之一（萬(wàn)貞元等，2014）。本研究的亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)給藥28d后，各劑量組小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐含量與空白對(duì)照組相比差異均不顯著，表明濃縮型獸用雙黃連口服液對(duì)小鼠的肝臟、腎臟功能無(wú)不良影響。

本研究還采集小鼠的肝臟、脾臟和腎臟制作病理組織切片，經(jīng)HE染色后，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)僅高劑量組小鼠的肝臟有損傷，肝細(xì)胞有點(diǎn)狀壞死灶，肝細(xì)胞索凌亂，細(xì)胞界限模糊不清，細(xì)胞核著色減弱，其他臟器組織切片均無(wú)異常變化，其原因可能是長(zhǎng)期灌服高劑量（24.00g/kg）濃縮型獸用雙黃連口服液會(huì)對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞造成輕微損傷。但綜合其他試驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為濃縮型獸用雙黃連口服液對(duì)小鼠仍具有較高的安全性。

4結(jié)論

濃縮型獸用雙黃連口服液對(duì)小鼠無(wú)急性毒性作用，長(zhǎng)期連續(xù)用藥也無(wú)亞慢性毒性作用，安全性較高。

（責(zé)任編輯蘭宗寶）