不同抗生素和防腐劑對小球藻Chlorella sorokiniana細胞生長的影響

李亞軍　朱為菊　費小雯　鄧曉東

摘要：[目的]分析不同抗生素和防腐劑對小球藻Chlorellasorokiniana細胞生長的影響，篩選出適宜的抗生素和防腐劑種類及其劑量，為建立小球藻C.sorokiniana無菌培養體系提供參考依據。[方法]在HSM培養基中分別添加10、20、40、60、80和100lag/mL抗生素，包括氯霉素、鏈霉素、青霉素、慶大霉素和頭孢噻肟，以及山梨酸鉀（50、100、150和200μg/mL）、乳酸鈉（0.5%、1.0%和2.0%）、富馬酸二甲酯（0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0和50.0μg/mL）等防腐劑，培養3d后測定小球藻C.sorokiniana的細胞密度、葉綠素含量及光系統Ⅱ最大光化學量子產量（F_v/F_m）。[結果]添加10～100μg/mL青霉素或10～80μg/mL頭孢噻肟對小球藻C.sorokiniana細胞密度、葉綠素含量和F_v/F_m的影響均不顯著（P>0.05，下同）；添加100μg/mL頭孢噻肟會抑制藻細胞生長，抑制率為18.89%，并引起葉綠素含量和F_v/F_m極顯著下降（P<0.01，下同）。氯霉素、鏈霉素和慶大霉素等蛋白質合成抑制類抗生素對小球藻C.sorokiniana細胞的毒性較強，高于10μg/mL的鏈霉素和慶大霉素及高于20μglmL的氯霉素均極顯著抑制藻細胞生長，對應的葉綠素含量和F_v/F_m也極顯著下降。3種防腐劑中，山梨酸鉀對小球藻C.sorokiniana細胞生長無顯著影響，添加200μg/mL山梨酸鉀還會促進細胞葉綠素含量增加；乳酸鈉對小球藻C.sorokiniana細胞有一定的毒性作用，其藻細胞密度、葉綠素含量和F_v/F_m隨添加濃度增加而降低；添加0.1～10.0μg/mL富馬酸二甲酯不影響小球藻C.sorokiniana的細胞密度及葉綠素含量，但F_v/F_m極顯著下降。[結論]建立小球藻C.sorokiniana無菌培養體系時宜選用青霉素和頭孢噻肟為抗生素、山梨酸鉀為防腐劑，其推薦使用濃度分別為青霉素100μg/mL、頭孢噻肟80μg/mL、山梨酸鉀200μg/mL。

關鍵詞：小球藻Chlorellasorokiniana；抗生素；防腐劑；細胞密度；葉綠素含量；F_v/F_m

中圖分類號：S963.213 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）11-2078-08

0引言

[研究意義]小球藻為一類單細胞真核生物，是綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、小球藻科、小球藻屬各種類的統稱，常見種類有普通小球藻（Chlorellavulgar-is）、橢圓小球藻（C.ellipsoidea）和蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa）等，其變種可達上百種。因其富含蛋白質、脂類、多糖和各種活性代謝產物，在醫藥保健、食品工業和水產動物餌料等方面具有極高的應用價值（孔維寶等，2010；羅柳茵等，2016）。獲得小球藻純種資源是其推廣應用的前提，但在藻種資源分離、培養及保存過程中，通常存在其他雜菌污染，而添加抗生素和防腐劑抑制雜菌生長是獲得小球藻純種最有效的途徑。不同藻種對抗生素和防腐劑的耐受力也各不相同，因此，篩選出適宜的抗生素和防腐劑種類及其劑量是建立小球藻無菌培養體系的關鍵。[前人研究進展]至今，已有10余種抗生素應用于微藻的無菌化培養，如常見的氯霉素、氨芐青霉素和卡那霉素等。微藻對抗生素的敏感性與其種類密切相關。萊茵衣藻、柵藻、單針藻、埃氏小球藻對氯霉素較敏感，超過20μg/mL即可抑制藻類細胞生長（楊芳芳等，2012；余旭亞等，2012；姜思等，2017；王亞君等，2017），但對普通小球藻和富油新綠藻不敏感，即使100μg/mL氯霉素也未影響其生長（周文禮等，2009；張茜等，2016）。大多數藻種如小球藻、小硅藻、塔胞藻、雨生紅球藻、萊茵衣藻、富油新綠藻和波吉卵囊藻對氨芐青霉素和青霉素均不敏感，對卡那霉素則較敏感（岳偉萍，2005；李靜紅等，2009；張茜等，2016；姜思等，2017；王亞君等，2017；鄭凌凌等，2017）；但也有研究報道小球藻藻種Chlorellasp.對青霉素敏感（麻曉霞等，2011）。低劑量四環素會抑制萊茵衣藻細胞的生長，但富油新綠藻不受其影響（姜思等，2017）。此外，Guo等（2016）研究發現，100μg/mL頭孢菌素（7-氨基頭孢霉烷酸）對小球藻、萊茵衣藻和麥可藻的生長抑制率分別為12.0%、9.6%和11.7%；Teixeira和Granek（2017）通過對比等鞭金藻、微擬球藻和角毛藻對抗生素甲氧芐氨嘧啶和磺胺甲惡唑的抗性，發現僅微擬球藻細胞生長受這兩種抗生素的抑制。[本研究切入點]海南具有豐富的藻種資源，但可商業化利用的純藻種非常少，尤其從自然水體中分離獲得的藻種通常帶有很多其他雜菌，藻細胞生長易受限制，且其培養液存儲時間非常短，一般3--4d即開始腐敗。因此，非常有必要在小球藻培養體系中添加抗生素和防腐劑以去除雜菌，進而提高小球藻生長速率和延長藻液存儲時間。[擬解決的關鍵問題]從自然水體中分離獲得一株小球藻，為推進其在水產動物餌料和食品添加劑領域中的應用，而急需獲得純藻種。通過分析不同抗生素（氯霉素、鏈霉素、青霉素、慶大霉素和頭孢噻肟）和防腐劑（山梨酸鉀、富馬酸二甲酯和乳酸鈉）對小球藻細胞生長的影響，篩選出適宜的防腐劑種類及其劑量，為建立小球藻無菌培養體系提供參考依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

小球藻藻種由農業部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室采用平板分離法從自然水體中分離得到，命名為HOC5。HSM培養基配方：NH4C10.50g/L、MgSO₄·7H₂O0.02g/L、CaCl₂·2H₂O0.01g/L、K₂HPO₄1.44g/L、KH₂PO₄0.72g/L和CH₃COOK2.00g/L。氯霉素、鏈霉素、青霉素、慶大霉素和頭孢噻肟購自美國mmresco公司，其試驗濃度梯度為10、20、40、60、80、100μg/mL，每個濃度梯度重復3次。山梨酸鉀、富馬酸二甲酯和乳酸鈉購自上海麥克林生化科技有限公司，其中，山梨酸鉀是根據GB2760-2014的相關規定，設50、100、150和200μg/mL4個濃度梯度；富馬酸二甲酯是參考吳暉等（2007）的方法，設0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0和50.0μg/mL7個濃度梯度；乳酸鈉則根據預試驗結果，設0.5%、1.0%和2.0%3個濃度梯度。

1.2DNA提取及藻種鑒定

將培養1周左右的藻種接種到50mL的HSM液體培養基中，于27℃下搖床（230r/min）培養3d。5000r/min離心5min，收集藻種，并置于研缽中加入適量石英砂，液氮研磨。取適量藻粉置于2mL離心管中，加入150μL無菌水、300μLSDS抽提液（2%SDS、400mmol/LNa2EDTA、100mmol/LTris-HCl，pH8.0）和5μLRNase（20μL/μL），混勻后室溫靜置15min。12000r/min離心10min，取上清液，以苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）和氯仿：異戊醇（24：1）依次各抽提一次。抽提獲得的DNA用無水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌一次后加入40μL無菌水溶解。

參照孫雪等（2009）的方法合成小球藻rDNAITS引物（ITS-F：5'-TTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAG-3'和ITS-R：5'-TTAAGTTCAGCGGGTAGTCTTGCC-3'）及rbcL引物（rbcL-F：5'-ATGKCTCCACAAACTGAAACTA-3和rbcL-R：5'-TTAAAGWGTATCGATWGTTTCGA一3）。利用PCR擴增小球藻的ITS序列和rbcL基因，并將其克隆至pMD18-T載體，挑選陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果在NCBI數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索，并采用MEGA5.2構建基于ITS和rbeL基因序列同源性的系統發育進化樹。

1.3小球藻細胞密度測定

每瓶培養基中加人1mL藻種（5×10⁶個/mL），培養3d后采用血球計數板測定各處理的藻細胞密度，并計算細胞抑制率：

抑制率（%）=（C₀-C）/C₀×100

式中，C₂表示未添加抗生素的小球藻細胞密度，C表示添加不同濃度抗生素后的小球藻細胞密度。

1.4葉綠素含量及F_v/F_m測定

取1mL小球藻培養液置于10mL玻璃管中，每管加入4mL丙酮，渦旋振蕩30s，4℃靜置1h后5000r/min離心5min，取上清液于波長645和663nm處測定吸光值，計算葉綠素含量：

葉綠素含量（mg/L）=（20.2×OD_645nm+8.02×OD_663nm）×V/1000

式中，V表示丙酮體積。

光系統Ⅱ最大光化學量子產量（F_v/F_m）反應植物潛在的最大光合能力，直接采用便攜式調制葉綠素熒光儀（mini-PAM）進行測定。

1.5統計分析

試驗數據采用SPSS19.0進行單因素方差分析（One-wayANOVA）和LSD多重比較分析。

2結果與分析

2.1小球藻藻種鑒定結果

以小球藻DNA為模板，PCR擴增獲得HOC5的ITS和rbcL基因序列長度分別為683和1429bp。ITS序列的同源性比對分析結果顯示，HOC5與小球藻科小球藻屬的Chlorellasorokiniana親緣關系最近（圖1）。基于rbcL基因同源性構建的系統發育進化樹也顯示出類似結果（圖2）。HOC5的細胞形態如圖3所示，為單細胞，浮游，呈圓形或橢圓形，色素體1個，環狀周生，細胞直徑4.5～5.5lam。綜合分子生物學和形態學鑒定結果，可將HOC5鑒定為Csorokiniana。

2.2不同抗生素對小球藻C.sorokiniana細胞密度的影響

小球藻C.sorokiniana在添加不同濃度抗生素的培養基中培養3d后，其細胞密度如圖4所示。與未添加抗生素（0μg/mL）的對照相比，添加10～100μg/mL青霉素并不影響小球藻C.sorokiniana細胞的生長；添加10-80μg/mL頭孢噻肟也不影響小球藻C.sorokiniana細胞增殖，但添加濃度達100μg/mL時，藻細胞密度明顯下降，該濃度對藻細胞生長的抑制率達18.89%（表1）；添加低濃度的氯霉素（0-20μg/mL）能有效促進藻細胞生長，當濃度超過20μg/mL后，藻細胞密度隨氯霉素添加濃度的增加而呈急劇下降趨勢，80和100μg/mL氯霉素對藻細胞生長的抑制率分別為20.94%和39.87%（表1）；鏈霉素和慶大霉素的添加濃度超過10μg/mL時，藻細胞生長受到嚴重抑制，抑制率分別為34.10%-54.64%和41.73%-64.30%（表1）。從圖5也可看出，與對照的深綠色培養液相比，藻細胞生長受抑制的培養液均呈淺綠色，尤其在添加60μg/mL及以上濃度的慶大霉素培養液中，培養液幾乎透明，其對應的抑制率均超過60.00%。

2.3不同抗生素對小球藻C.sorokiniana光合作用的影響

由圖6可看出，小球藻C.sorokiniana的葉綠素含量與細胞密度的變化趨勢基本一致。與未添加抗生素（0μg/mL）的對照相比，添加青霉素基本上不影響小球藻C.sorokiniana的葉綠素含量；添加20μg/mL及以上的慶大霉素和鏈霉素進行培養時，小球藻C.sorokiniana的葉綠素含量呈極顯著下降趨勢（P<0.01，下同）；添加60μg/mL及以上的氯霉素進行培養時，小球藻C.sorokiniana的葉綠素含量呈顯著（P<0.05，下同）或極顯著下降趨勢；添加10～80μg/mL頭孢噻肟進行培養時，小球藻C.sorokiniana的葉綠素含量無顯著變化（P>0.05，下同），但添加濃度增至100μg/mL后，其葉綠素含量極顯著下降。

由圖7可看出，添加青霉素對小球藻C.sorokinia-na的F_v/F_m無顯著影響。與正常培養的小球藻C.so-rokiniana相比，添加20和40μg/mL慶大霉素培養的小球藻F_v/F_m極顯著下降，而添加60-100g/mL慶大霉素培養的小球藻C.sorokiniana因其細胞密度過低，未檢測出F_v/F_m；添加60-100g/mL氯霉素和鏈霉素能極顯著降低小球藻C.sorokiniana的F_v/F_m。

2.4不同防腐劑對小球藻C.sorokiniana細胞密度的影響

由圖8可看出，添加0.5%和1.0%乳酸鈉尚未明顯阻礙小球藻C.sorokiniana細胞的生長，但添加2.0%乳酸鈉后藻細胞密度下降50%左右；培養液中添加50-200μg/mL山梨酸鉀對藻細胞密度無顯著影響；小球藻C.sorokiniana培養液添加富馬酸二甲酯的適宜濃度為0.1～10.0μg/mL，添加濃度為25.0和50.0μg/mL時藻細胞幾乎不能生長（圖9）。

2.5不同防腐劑對小球藻C.sorokiniana光合作用的影響

由圖10可看出，乳酸鈉會降低小球藻C.soroki-niana的葉綠素含量，添加2.0%乳酸鈉時其葉綠素含量極顯著下降；添加山梨酸鉀對小球藻C.sorokiniana的葉綠素含量無顯著影響；添加0.1-10.0μg/mL富馬酸二甲酯也不影響小球藻C.sorokiniana的葉綠素含量，但添加濃度超過25.0μg/mL后葉綠素含量極顯著下降。在F_v/F_m方面，添力10.5%-2.00/4L酸鈉及0.5-10.0gg/mL富馬酸二甲酯培養的小球藻C.sorokiniana，其F_v/F_m較未添加防腐劑（0μg/mL）的對照極顯著下降，表明潛在的最大光合能力受到抑制。

3討論

青霉素主要通過抑制轉肽酶阻礙細菌的細胞壁合成，從而達到抗菌目的；頭孢噻肟為第三代頭孢菌素，與青霉素同屬于β-內酰胺類抗生素。本研究結果表明，小球藻C.sorokiniana對這兩種抗生素不敏感，僅高濃度（100μg/mL）的頭孢噻肟會引起藻細胞密度和葉綠素含量下降，同時潛在的最大光合能力極顯著下降。除小球藻外，波吉卵囊藻和富油新綠藻對青霉素也不敏感（李靜紅等，2009；張茜等，2016），但周文禮等（2009）報道低于100μg/mL的青霉素能促進普通小球藻葉綠素a含量增加。本研究也發現青霉素對小球藻C.sorokiniana細胞葉綠素含量無顯著影響，可能是藻種不同的原因。頭孢噻肟為7一氨基頭孢霉烷酸（7ACA）的衍生物，二者抗菌機制相似。Guo等（2016）報道100μg/mL7一氨基頭孢霉烷酸對小球藻Chlorellasp.的抑制率為12.00%，本研究中100μg/mL頭孢噻肟對小球藻C.sorokiniana的抑制率為18.96%，但Fu等（2017）研究證實細菌細胞壁合成抑制類抗生素（頭孢噻肟和氨芐青霉素）對微藻的毒性作用很小。不同藻種對抗生素的敏感性各不相同，除了與其種屬有關外，還與培養基的組分有關。李杰等（2003）、楊芳芳等（2012）曾研究報道，以固體和液體培養基培養獲得的微藻對同一抗生素的敏感性也不相同。

氯霉素和鏈霉素的抗菌作用機制是分別與細菌核糖體蛋白的50S和30s亞基相結合，使細菌蛋白質合成受阻，而達到抑菌目的。慶大霉素與鏈霉素的抗菌作用機制相似，也是與細菌核糖體蛋白30S亞基相結合，只是慶大霉素較鏈霉素具有更廣的抗菌譜和更強的抗菌活性。已有研究證實，萊茵衣藻、柵藻、埃氏小球藻和單針藻對氯霉素非常敏感（余旭亞等，2012；姜思等，2017；王亞君等，2017），但也有研究報道真眼點藻、富油新綠藻、金藻和普通小球藻對100μg/mL及以下濃度的氯霉素不敏感（周文禮等，2009；楊芳芳等，2012；張茜等，2016）。Seoane等（2014）研究發現，培養基中添加氯霉素24h后，綠藻Tetraselmissuecica的生長和細胞活性均未受影響，但與光合作用相關的各項參數，如葉綠素a含量顯著下降，表明氯霉素對T.suecica有一定毒性。在鏈霉素和慶大霉素方面，Magdaleno等（2015）研究表明慶大霉素對月牙藻的毒性作用非常大，半數有效濃度（EC₅₀）為19.2mg/L；張茜等（2016）、王亞君等（2017）研究發現富油新綠藻、埃氏小球藻和單針藻對鏈霉素非常敏感；鄭凌凌等（2017）研究證實雨生紅球藻對鏈霉素和慶大霉素均非常敏感。本研究結果表明，氯霉素、鏈霉素和慶大霉素等蛋白質合成抑制類抗生素對小球藻C.sorokiniana細胞的毒性較強，高于10μg/mL的鏈霉素和慶大霉素及高于20μg/mL的氯霉素均極顯著抑制小球藻C.sorokiniana細胞生長，對應的葉綠素含量和F_v/F_m也極顯著下降。

山梨酸鉀為常用的食品防腐劑。孫建華等（1998）曾報道，山梨酸鉀可用于高濃度小新月菱形藻的保存。本研究結果表明，添加50-200μg/mL山梨酸鉀不會影響小球藻C.sorokiniana生物量的累積，當添加濃度達200μg/mL時藻細胞密度略有增加，潛在的最大光合能力也明顯上升。乳酸鈉和富馬酸二甲酯尚無應用于微藻無菌培養及保存的研究報道。本研究發現，小球藻C.sorokiniana的細胞密度、葉綠素含量及F_v/F_m均隨乳酸鈉濃度增加而降低，表明乳酸鈉對小球藻C.sorokiniana細胞有一定的毒性作用；添加0.1-10.0μg/mL富馬酸二甲酯不影響小球藻C.sorokiniana的細胞密度及葉綠素含量，但F_v/F_m極顯著下降，表明富馬酸二甲酯會抑制小球藻C.sorokiniana潛在的最大光合能力。

4結論

青霉素和頭孢噻肟等破壞細菌細胞壁合成的抗生素對小球藻生長影響較小，而氯霉素、鏈霉素和慶大霉素等抑制細菌蛋白質合成的抗生素對小球藻毒性較大。山梨酸鉀不影響小球藻的生長，乳酸鈉會抑制小球藻細胞生長，且添加濃度越高抑制作用越明顯。因此，建立小球藻C.sorokiniana無菌培養體系時宜選用青霉素和頭孢噻肟為抗生素、山梨酸鉀為防腐劑，其推薦使用濃度分別為青霉素100μg/mL、頭孢噻肟80μg/mL、山梨酸鉀200μg/mL。

（責任編輯蘭宗寶）