抗黃曲霉毒素B1單鏈抗體基因克隆及其結構分析

馬蘭　劉愛平　王佳　王小紅

摘要：[目的]克隆構建黃曲霉毒素B1（AFB1）單鏈抗體（scFv）基因，并對其編碼蛋白序列和結構進行分析預測，為scFv分子修飾改造及在免疫學檢測中的應用提供參考依據。[方法]以抗AFBl單克隆抗體雜交瘤細胞株為原料，通過PCR擴增重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），以（Gly₄Ser），為柔性接頭（Linker）拼接構建抗AFBlscFv基因，并采用在線生物信息學分析軟件對其氨基酸序列、理化性質及蛋白結構進行分析預測。[結果]抗AFBlscFv基因全長744bp，編碼248個氨基酸，分子量為26312.05Da，理論等電點（pI）5.70，其二級結構中含有35個α-螺旋（占14.11%）、28個β-折疊（占11.29%）、85個延伸鏈（占34.28%）和100個隨機卷曲（占40.32%），在三級結構中連接肽卷曲將VH和VL區域牽拉而相互靠近，形成典型的抗體結構——溝槽結構，是scFv的抗原結合區域。[結論]構建的抗AFBlscFv其VH含有117個氨基酸、VL含有116個氨基酸，具備典型抗體結構——溝槽結構，能與抗原特異性結合。

關鍵詞：黃曲霉毒素B1（AFB1）；單鏈抗體（scFv）；重鏈可變區（vH）；輕鏈可變區（VL）；溝槽結構

中圖分類號：S859.87 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）11-2064-07

0引言

[研究意義]黃曲霉毒素（Anatoxins，AFTs）是由黃曲霉（Aspergillusflavus）、寄生曲霉（A.parasiti-CUS）等真菌產生的有毒次級代謝產物，至今共發現20多種黃曲霉毒素及其衍生物（Delmulleeta1.，2005；李鑫等，2012a），其中以黃曲霉毒素B1（AFBl）的毒性最強，已被世界衛生組織癌癥研究機構列為I類致癌物質（莊振宏等，2011）。由于AFB1污染食品及其原料范圍廣，對人類健康具有極大危害，因此非常有必要針對其建立一種準確、快速的檢測方法。根據AFBl溶解性、光譜學特性等建立的檢測方法有薄層色譜法、氣相色譜分析法、高效液相色譜分析法等，雖然檢測靈敏度和準確性高，但檢測成本高、前處理復雜，不適用于大批量樣品陽性篩查。免疫分析法是基于抗原抗體特異性反應對AFB1進行定性和定量分析，具有方便、快速、成本低、特異性高等優點（孫清，2016）。抗體作為免疫分析的核心試劑，經歷了多克隆抗體、單克隆抗體到基因工程抗體的發展。單鏈抗體（Singlechainantibodvfragment，scFv）是一類典型的基因工程抗體，由一段多肽鏈（Linker）將抗體重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）連接而成（Hustoneta1.，1988），具有生產周期短、批次問差異小、可基因修飾等優點，尤其在AFB1等小分子污染物檢測中具有廣闊的應用前景。[前人研究進展]scFv分子量為26-28kD，是傳統抗體的1/5，但仍保持與待測物結合的特異性和檢測靈敏性，是生物毒素檢測領域最常用的基因工程抗體（Bazineta1.，2017）。在原核表達系統中，scFv制備一般有兩種途徑（Lieta1.，2013）：一種是基于噬菌體展示技術，從脾細胞中提取并擴增重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），構建噬菌體展示單鏈抗體文庫，通過“吸附-洗脫-擴增”過程從中篩選出與AFBl親和力強的scFv（Edupugantieta1.，2013；Wangeta1.，2016；徐重新等，2017）；另一種途徑是通過提取陽性單克隆雜交瘤細胞的RNA，體外將VH和VL連接，無需借助噬菌體展示體系，可避免展示文庫構建和篩選等繁瑣的步驟，但此法會降低scFv與目標物的親和力，一般比單克隆抗體低10-100倍（Hueta1.，2015）。孫憲連（2006）首次應用噬菌體展示技術成功制備獲得抗AFBlscFv；李鑫等（2012b）從單克隆細胞株8F6中克隆得到抗AFB1scFv，實現了scFv在大腸桿菌中的表達，并建立了間接競爭免疫分析方法，對AFBl的半抑制率（IC50）為0.57ng/mL；Li等（2013）通過提取20多株抗AFBl單克隆抗體陽性雜交瘤細胞的總RNA，構建了抗AFB1scFv文庫，庫容為3.5×10₅CFU。此外，scFv也可在真核表達系統中表達。王婷等（2017）通過擴增抗AFBlscFv基因，將其轉入畢赤酵母表達系統，用0.8%甲醇可誘導scFv發生可溶性表達。scFv的另一個優勢是其基因序列已知，通過對其蛋白結構的預測和分析可精確定位抗原抗體的結合位點（Hueta1.，2016），為體外改造和促進抗原抗體親和力提供技術支持。Min等（2015）從酵母突變文庫中篩選獲得抗AFBlscFv，分析該抗體氨基酸序列，結果發現其突變子通過變構效應與AFB1形成一個結合區域，從而提高抗體親和力。[本研究切入點]為提高scFv的應用價值，當前研究主要通過構建或擴大抗體文庫等方式篩選出合適的scFv，但針對抗AFB1scFv重組構建及其性質分析的研究鮮見報道。[擬解決的關鍵問題]以AFBl為研究對象，擴增抗AFB1抗體的VH和VL基因，通過柔性接頭將二者拼接以構建抗AFB1scFv，并對其理化性質和蛋白結構進行分析預測，為scFv分子修飾改造及在免疫學檢測中的應用提供參考依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

抗AFBl單克隆抗體雜交瘤細胞株由華中農業大學食品生物技術與安全實驗室構建提供；T100^TMThermalCyclerPCR儀、蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳和凝膠成像系統分析儀購自美國Bio-Rad公司；58IOR冷凍高速離心機購自德國Eppendorf公司；DNA聚合酶、限制性內切酶NcoI和BamHI及大腸桿菌DH5a感受態細胞購自美國NewEnglandBiolab公司；RevertAidTMcDNA單鏈合成試劑盒購自美國Roche公司；其他相關試劑均為國產分析純。

1.2抗AFBl單克隆抗體雜交瘤細胞株總RNA提取

從液氮罐中取出凍存的抗AFBl單克隆抗體雜交瘤細胞株，迅速放入37℃水浴鍋中解凍后置于完全培養液中復蘇。收集處于對數生長期的細胞，加入1.0mLTrizol試劑混合均勻，室溫下靜置5min后加入200.0μL三氯甲烷，混勻后靜置10min，12000r/min離心15min，將含有RNA的上清液轉移至無菌離心管中，再加入等體積異丙醇，靜置10min沉淀RNA，12000r/min離心20min，棄上清液，加入75%乙醇洗滌沉淀兩次，離心后加/k50.0μL經DEPC處理的無菌水溶解RNA，取少量RNA測定其濃度和純度，剩余RNA于80℃保存備用。

1.3cDNA第一鏈合成

以RNA為模板，反轉錄合成cDNA：取5.0μLRNA，加入5.0μL5×緩沖液、2.0μLdNTP（2.5mmol/L）、1.0μLOligo（dT）Primer（50μmol/L）、2.0μLRNase抑制劑和0.5μL逆轉錄酶（200U/μL）。反轉錄程序：25℃10min，42℃1h，70℃15min。合成的cDNA于-80℃保存備用。

1.4VH和VL基因擴增

以cDNA為模板PCR擴增抗體可變區VH和VL基因，參照Zhou等（1994）的方法設計引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系25.0μL：1.5μLcDNA模板，2.5μL10×緩沖液，1.0μLdNTP（2.5mmol/L），1.0μL正、反向引物（10gmol/L），0.2gLDNA聚合酶，無菌純水補足至25.0μL。擴增程序：94℃預變性4min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，進行25個循環；72℃延伸7min。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，以QIAquickGelExtractionKit試劑盒回收純化PCR產物（VH和VL基因片段）。

1.5抗AFBlscFv基因構建

利用重疊延伸PCR（sOE-PCR）構建VH-linker-VL順序的scFv基因，連接肽為（Glv4Ser）₃。以1.0μLVH基因片段為模板，引物采用VH-linker-For和VH-linker-Back（表1），加入2.5μL10×PCR緩沖液、1.0μLdNTP（2.5mmol/L）和DNA聚合酶，無菌純水補足至25.0μL，擴增VH-linker基因片段；擴增程序與1.4一致。同理采用VL-linker-For和VL-linker-Back擴增VL-linker基因片段。以VH-linker和VL-linker各1.0μL互為模板，VH-linker-For和VL-linker-Back為引物（表1），擴增scFv基因；擴增程序與1.4一致，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。

1.6抗AFBlscFv重組質粒構建

用限制性內切酶NcoI和BamH1分別酶切scFv基因和pET-3d載體，酶切產物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，按QIAquickGelExtractionKit說明回收目的條帶，然后連接回收的酶切產物，連接反應體系：30ng基因片段，30ng載體質粒，0.5μLT4DNA連接酶，1.0μLT4DNA連接酶緩沖液，16℃過夜連接。連接產物轉化DH5a感受態細胞。挑取LB培養基上的單克隆，提取質粒，陽性重組質粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.7scFv基因序列比對分析

根據scFv基因序列，采用Bioedit翻譯成氨基酸，并將翻譯結果輸入Igmt/v-Quest（http：//www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest）中，對scFv的框架區（FR）和超變區（cDR）進行劃分。同時，在NCBI數據庫中對其堿基序列和氨基酸序列進行比對分析，明確與其他抗體蛋白的同源性。

1.8scFv蛋白結構預測

根據scFv氨基酸序列，采用ExPASyProteomicsTools中的ProtParam程序（http：//web.expasy，org/prot-param/）計算其蛋白分子量、等電點等參數（Bazineta1.，2017），并以NPS@SOPMA程序（https：//npsa-pra-bi.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl？page=npsasopma.html）預測該抗體蛋白二級結構。在SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）中輸入scFv氨基酸序列，通過序列比對找到與目標蛋白相似性較高且具有已知結構的序列，推測scFv蛋白的三級結構。

2結果與分析

2.1scFv可變區基因的擴增結果

提取獲得的抗AFB1單克隆抗體雜交瘤細胞株總RNA在凝膠成像系統中可觀察到3條明顯的條帶，分別為28SRNA、15SRNA和5SRNA（圖1）。以RNA為模板，反轉錄合成cDNA后擴增VH和VL基因片段，結果均擴增得到單一的特異性條帶，兩個片段大小約350bp（圖2），與預期結果相符。

2.2scFv基因構建及序列鑒定結果

回收VH和VL基因片段，以SOE-PCR構建VH-linker-VL順序的scFv基因，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到大小約750bp的目的條帶（圖3），與預期結果相符。將scFv基因連接至pET-3d載體構建獲得的DET-3d-scFv重組質粒經NcoI和BamHI雙酶切鑒定，結果獲得兩條清晰的目的條帶（圖4），其大小分別為4600和750bp。以pET-3d通用引物測定雙酶切獲得的scFv基因序列，結果表明，scFv基因片段大小為744bp，其中VH片段為351bp、VL片段為348bp。

2.3scFv氨基酸序列分析及其同源性比對結果

Bioedit翻譯得到的scFv氨基酸序列如圖5所示，經Igmt/v-Quest劃分得知VH含有117個氨基酸，VL含有116個氨基酸。由表2和表3可知，VH和VL基因堿基序列及其推導氨基酸序列均有相對應的高同源性VH和VL，即可基本確認克隆獲得的VH基因和VL基因是小鼠免疫球蛋白可變區基因，且比對結果表明VL的類型為Kappa鏈。

2.4scFv蛋白理化性質及其結構預測結果

通過ExPASyProteomicsTools中的ProtParam程序在線預測分析，得知scFv蛋白含有248個氨基酸，分子量為26312.05Da，理論等電點（pI）5.70。以NPS@SOPMA預測scFv蛋白的二級結構，結果顯示其二級結構中含有35個α-螺旋，占總數的14.11%；28個β-折疊，占11.29%；85個延伸鏈，占34.28%；100個隨機卷曲，占40.32%。通過SWISS-MODEL在線分析scFv氨基酸序列與模板5'GRU（ProteinDataBank編號）的同源性，結果發現二者的相似性為78.02%。由圖6可看出，在scFv蛋白三級結構中連接肽卷曲將VH和VL區域牽拉而相互靠近，形成典型的抗體結構——溝槽結構，是scFv的抗原結合區域。其中紅色部分為重鏈，藍色部分為輕鏈，銀色部分為柔性多肽（Linker）。

3討論

與傳統的多克隆抗體和單克隆抗體相比，scFv的分子量小，僅為傳統抗體的1/5，能更好地穿透組織，可在基因水平上進行改造，且在大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、植物細胞等表達系統中均能表達（Wardeta1.，1989；劉金鳳等，2015；劉愛平等，2016），但scFv也存在自身缺陷，主要表現為穩定性差、親和力不如單克隆細胞株，在原核表達系統中通常以包涵體的形式表達等（Wangeta1.，2006），進而限制其在生物醫學和環境檢測方面的推廣應用。依據scFv基因序列的已知優勢，在一定程度上可為scFv的實際應用提供優化策略。如通過分析目標物不同親和力的氨基酸序列，可確定抗體某一區域對于目標物結合能力的影響，從而獲得特異性結合位點。因此，通過對scFv蛋白的序列分析和結構解析能更精確地定位其生物功能。

目前，接近90%的蛋白結構是采用X射線衍射技術進行測定，該方法雖然能獲得精確的蛋白晶體結構，但操作復雜、儀器昂貴，對抗體純度要求高（李少暉等，2015）。隨著分子生物學和生物信息學的快速發展，基因序列信息越來越容易獲得。因此，在線數字化分析系統已成為蛋白功能研究必不可少的工具。同源建模（Homologymodeling）是一種實用、可靠的蛋白質結構預測方法，通過與數據庫中已知序列x射線晶體衍射比對，選取具有高度保守性的氨基酸序列，同源性在50%以上時再以理論計算方法對其進行結構優化。基于抗體的氨基酸序列和結構，對某些特定位置進行定點突變的策略可用于提高抗體親和力。Li等（2012）通過分析抗AFBl單克隆抗體的氨基酸序列及預測其結構，發現該單克隆抗體上第49位絲氨酸（Ser）與第103位纈氨酸（Val）問的氫鍵和疏水作用對實現抗原與抗體的結合起重要作用。Min等（2016）在分析抗AFBlscFv氨基酸序列和結構的基礎上，將VHFR4的第110位丙氨酸突變成蘇氨酸（¹¹⁰Ala→Thr），其親和力提高了3.2倍。本研究成功構建獲得抗AFBlscFv基因，并采用在線生物信息學分析軟件對其氨基酸序列、理化性質及蛋白結構進行分析預測，結果顯示，scFv基因片段大小為744bp，其中VH片段為351bp、VL片段為348bp，經Igmt/v-Quest劃分得知VH含有117個氨基酸，VL含有116個氨基酸，二者均為小鼠免疫球蛋白可變區基因：scFv蛋白含有248個氨基酸，分子量為26312.05Da，理論等電點（pI）5.70，其二級結構中含有35個α-螺旋（占14.11%）、28個β-折疊（占11.29%）、85個延伸鏈（占34.28%）和100個隨機卷曲（占40.32%），在三級結構中連接肽卷曲將VH和VL區域牽拉而相互靠近，形成典型的抗體結構——溝槽結構，是scFv的抗原結合區域。該結果為scFv基因的表達、純化、活性及親和力研究等后續工作提供了重要的參考依據，也為確定關鍵氨基酸結合位點、改變結合部位的氨基酸序列或空間構像提供了基礎信息，從而實現scFv的體外進化及提高其實際應用能力。

4結論

構建的抗AFBlscFv其VH含有117個氨基酸、VL含有116個氨基酸，具備典型抗體結構——溝槽結構，能與抗原特異性結合。

（責任編輯蘭宗寶）