黨參無菌苗培養前種子消毒技術研究

薛雯心 魏鐵鎖 袁金月 劉立業 姜雪琪 李秀霞

摘要[目的]研究不同消毒方法下黨參種子的消毒效果。[方法]以黨參種子為試驗材料，通過10%H2O2、0.1%HgCl2和2%NaClO這3種消毒劑，75%乙醇預處理，無菌水預浸泡，對黨參種子的消毒效果進行比較。[結果]在10%H2O2、0.1%HgCl2和2%NaClO這3種消毒劑中，2%NaClO浸種20 min的消毒效果最好；用75%乙醇預處理20 s可降低種子帶菌率；在黨參種子消毒之前，無菌水預浸泡24 h可提高發芽率。[結論]該研究結果為培育黨參無菌苗等研究提供了重要依據。

關鍵詞黨參；種子消毒；無菌苗

中圖分類號S567.5+3文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）12-0130-02

Abstract[Objective]To study the disinfection effects of Codonopsis pilosula seedling under different disinfection treatments.[Method]Taking C.pilosula seeds as test materials，through three kinds of disinfectants 10%H2O2， 0.1% HgCl2 and 2% NaClO，pretreatment with 75% ethanol and presoaking with sterile water，the effects of

C.pilosula seed sterilization were studied.[Result]2%NaClO had the greatest sterilization effect.The germcarring rate of seed was decreased with pretreatment of 75% ethanol.The seeds were soaked in aseptic water for 24 hours before sterilization，the seeds germination rate could increase.[Conclusion]The results of this study provide an important basis for the research on the cultivation of sterile seedlings of C.pilosula.

Key wordsCodonopsis pilosula；Seed disinfection；Aseptic seedling

黨參[Codonopsis pilosula（Franch.） Nannf.]為桔梗科多年生藤本植物，分布于甘肅、山西、四川、云南和黑龍江等地，其性味甘平、無毒，有活血化淤、補中益氣、生津止渴等功效，主治脾肺虛弱、內熱消渴、食少便溏、氣短心悸、虛喘咳嗽等癥[1]，為我國傳統的補益藥，臨床上可單獨使用，也可以與其他中藥配合使用。近年來，在黨參治療冠心病、高血脂癥、低血壓病和功能性子宮出血等病癥方面取得了新的進展，并將黨參用于保健食品的研制與開發，使其用量速增[2]。

黨參的市場需求量很大，傳統的遺傳育種易受環境[3]、季節和病蟲害的影響，而且傳統的遺傳育種有生長周期長、見效慢等缺點[4-5]。建立黨參組織培養高頻再生體系，可以為以后培育新的品種奠定基礎。用黨參種子培育無菌苗，再將獲取的外植體用于組織培養顯得至關重要。筆者研究了不同消毒方法對黨參種子消毒效果的影響，探索出黨參無菌苗培養前種子最佳消毒方法，為黨參無菌苗的培育提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料黨參種子由佳木斯大學生命科學學院經濟植物研究所提供。浸種消毒劑為10%H2O2、0.1%HgCl2和2%NaClO；表面消毒劑為75%乙醇；種子預浸泡處理采用無菌水；培養基為MS培養基。

1.2方法

1.2.1最佳消毒劑及消毒時間的選擇。

該試驗為2 因子試驗，因子 1 為消毒劑，包括 3 個處理：10%H2O2、0.1%HgCl2、2%NaClO；因子2為消毒時間，即每種消毒劑分別處理10、20、30 min。共9個處理組合，每處理3次重復，每重復 50 粒種子。消毒后的種子用無菌水沖洗 5～6次，每次1～2 min，然后將種子接種于 MS 培養基，觀察培養，計算黨參種子的平均帶菌率和平均發芽率。

1.2.2乙醇預處理的選擇。

選籽粒飽滿、大小基本一致的種子200粒，分為2組（即2個處理），每處理100粒種子，每處理3次重復，每重復 50 粒種子。處理 1：將種子在75%乙醇中預浸泡20 s，再用2%NaClO消毒處理；處理 2：種子不經過乙醇浸泡，直接用2%NaClO進行消毒。將不同處理的黨參種子接種于 MS 培養基，對試驗結果觀察并記錄。

1.2.3種子預浸泡的選擇。選籽粒飽滿、大小基本一致的種子450粒，分為3組（即3個處理），每處理 150 粒種子。處理 1：將種子用無菌水在常溫下浸泡12 h；處理 2：將種子用無菌水在常溫下浸泡 24 h；處理 3：種子不浸泡。將3個處理分別用75%乙醇浸泡20 s，再用2%的NaClO消毒20 min。最后將不同處理的黨參種子接種于 MS 培養基，每處理3次重復，每重復 50 粒種子，用高分子膜封口，觀察并統計試驗結果。

2結果與分析

2.1不同消毒劑和消毒時間對種子消毒效果的影響

從表1可以看出，不同消毒劑處理的黨參種子，表現出不同的效果。10%H2O2消毒10 min的種子發芽率為43.33%，培養基呈紅色，污染十分嚴重，不利于無菌苗的種子培養，10%H2O2消毒20 min的種子發芽率為66.67%，較10%H2O2消毒10 min的種子發芽效果好，10%H2O2消毒30 min的種子發芽率為48.00%。0.1%HgCl2消毒10 min的種子發芽率為57.33%，0.1%HgCl2消毒20 min的種子發芽率為83.33%，0.1%HgCl2消毒30 min的種子發芽率為62.67%。可見，0.1%HgCl2消毒處理后的種子發芽率均高于用10%H2O2消毒處理后的種子發芽率。2%NaClO消毒10 min的種子發芽率為81.33%，2%NaClO消毒20 min的種子發芽率最高，為90.00%，2%NaClO消毒30 min的種子發芽率為80.00%。0.1%HgCl2消毒20 min的種子發芽率（83.33%）僅次于2%NaClO浸種20 min的種子發芽率（90.00%）。但是，將0.1%HgCl2浸種20 min和2%NaClO浸種20 min的消毒效果相比較，前者的污染率明顯高于后者。綜合以上結果，2%NaClO浸種20 min消毒效果最佳。

2.2乙醇預處理對黨參種子消毒效果的影響

75%乙醇浸泡20 s與不浸泡黨參種子2個處理的結果表明，75%乙醇浸泡20 s的種子平均帶菌率低于不浸泡處理。由表2可知，75%乙醇浸泡20 s的種子平均帶菌率為7.00%，比不浸泡處理低2.00百分點。而且，75%乙醇浸泡20 s的種子發芽率為91.00%，明顯高于不浸泡處理。可見，75%乙醇浸泡20 s對種子消毒有很好的效果。

2.3預浸泡對黨參種子消毒效果的影響

從表3可以看出，黨參種子不浸泡處理的平均發芽率顯著低于浸泡處理。未經過無菌水預浸泡處理的種子發芽率為86.00%，無菌水浸泡12 h的種子發芽率為92.00%，無菌水浸泡24 h的種子發芽率最高，為94.67%。不浸泡處理的種子帶菌率比浸泡12 h的種子帶菌率高2.00百分點，比浸泡24 h的種子帶菌率高6.00百分點，浸泡24 h的種子平均帶菌率最低，為1.33%。從以上結果可以看出，無菌水浸泡24 h能有效提高種子發芽率，同時降低種子帶菌率。

3結論與討論

該試驗中HgCl2的消毒效果不如NaClO，雖然0.1%HgCl2消毒20 min的發芽率僅次于2%NaClO消毒20 min的處理，但HgCl2處理的種子污染率普遍高于NaClO處理。用10%H2O2對黨參種子消毒處理時，消毒時間過短，培養基污染十分嚴重，消毒時間過長，種子會向外滲透營養物，所以不適宜選H2O2作為黨參種子的消毒劑。試驗發現，殘留在種子上的消毒劑也會影響種子發芽率，所以，經過消毒劑處理后的種子要用無菌水沖洗5～6次，每次1～2 min。綜合以上結果，用2%NaClO浸種20 min是最佳選擇。

由試驗結果可知，采用75%乙醇浸泡預處理種子，有效降低了種子帶菌率，種子經75%乙醇浸泡預處理后再用2%NaClO消毒，比直接用2%NaClO消毒的種子帶菌率低2.00百分點。而且75%乙醇浸泡預處理消毒后的種子發芽率為91.00%，比不浸泡處理的種子發芽率高6.00百分點。75%乙醇能有效降低種子表面的帶菌率，但預處理時間不能太長，20 s為處理黨參種子的最佳時間。

黨參種子浸泡與否對消毒效果的影響研究表明，種子經浸泡后，其種皮結構變松軟[6]，消毒劑更易滲入。在種子消毒之前，無菌水浸泡12 h后再經2%NaClO消毒的種子帶菌率為5.33%，無菌水浸泡24 h后再經2%NaClO消毒的種子帶菌率為1.33%，而未經過無菌水浸泡的種子帶菌率為7.33%。發芽率最低的為不浸泡的種子，浸泡12 h的種子比不浸泡種子的發芽率高6.00百分點，浸泡24 h比浸泡12 h的種子發芽率高2.67百分點。可見，種子預浸泡能提高消毒劑的消毒效果，無菌水預浸泡24 h有效提高了種子發芽率。

參考文獻

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[4] 熊麗，吳麗芳.觀賞花卉的組織培養與大規模生產[M].北京：化學工業出版社，2003：80-83.

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[6] 胡重怡，鄭少清，陳興江，等.煙草無菌苗培養前的種子消毒技術研究[J].中國煙草科學，2007，28（2）：45-46.