煙草種質資源T1203對煙草花葉病的抗性特點

于海芹　饒思蓮　趙丹陽　劉勇　李永平

摘要：[目的]系統了解煙草種質資源T1203抗煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的特點，為煙草抗病育種的親本選擇提供更豐富信息。[方法]以煙草種質資源T1203為材料，采用TMV病毒接種、病情調查、病毒外殼蛋白累計量檢測、TMV復制水平測定及日灼現象觀察等方法，研究T1203對TMV的抗性特異性、T1203接種TMV普通株系（TMV-U1株系）后的癥狀、病毒復制水平等。[結果]T1203只對TMV表現無癥狀的抗病特點，接種馬鈴薯Y病毒（PVY）和黃瓜花葉病毒（CMV）則表現出典型癥狀。接種TMV-Ul株系后14d，Western blotting檢測結果顯示，T1203葉片病毒復制水平明顯低于對照品種；用表達GFP的TMV侵染性克隆浸潤接種發現，T1203對TMV的抗性發生在病毒復制水平。在高溫和強日照條件下，T1203生長迅速的中上部葉片會發生日灼現象，且難以恢復。[結論]T1203只對TMV表現無癥狀，其對TMV的抗性發生在病毒復制水平。

關鍵詞：煙草種質；T1203；煙草花葉病毒（TMV）；抗病性

中圖分類號：S286.3 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）11-2004-06

0引言

[研究意義]煙草花葉病毒病是我國煙草上的重要病害，每年造成的損失位列十大侵染性病害前茅（劉勇等，2006），種植抗病品種是防控煙草花葉病于海芹等：煙草種質資源T1203對煙草花葉病的抗性特點毒（Tobacco mosaic virus，TMV）最經濟、有效的手段（許石劍等，2009）。研究表明，烤煙品種TMV抗性由一個顯性單基因州空制，N基因來源于煙草野生種心葉煙（Nicotiana glutinosa）（Holmes，1960），通過一系列的回交轉育和常規雜交，心葉煙中包含N基因的染色體片段轉育至香料煙中，然后轉育至白肋煙和烤煙品種中（Chaplin and Gooding，1969；Chaplinand Mann，1978；Beekwilder，1999）。雖然Ⅳ基因可有效抑制TMV的復制和傳播，但包含Ⅳ基因的染色體片段存在與Ⅳ基因高度連鎖控制不利性狀的基因，不利性狀表現為相對較低的產量、貪青晚熟等，限制了包含Ⅳ基因的種質資源在育種中的使用。因此，有必要尋找新的抗TMV種質資源，以便提高煙草的TMV抗性且無不利性狀。[前人研究進展]Nolla和Roque于1933年在哥倫比亞研究發現，無Ⅳ基因煙草種質Ambalema接種TMV后無感染TMV的典型癥狀，但可檢測到少量病毒。后來Valleau（1952）將Ambalema的抗病類型稱為無癥狀（Symptomless）。1969年Chaplin和Goodling在對907份煙草資源接種TMV進行抗性鑒定時發現，除了常見的過敏性壞死反應抗病表型和花葉癥狀外，還發現更多煙草種質表現無癥狀。陳海如和范靜華（1991）報道，煙草種質Ambalema接種TMV后表現無癥狀，但從植株各葉齡葉片上均能檢測出TMV。Beekwilder（1999）將從無癥狀葉片中提取的汁液接種到TMV枯斑寄主上，3-7d后接種葉出現壞死斑，證明無癥狀個體雖然肉眼看不出明顯的感病癥狀，但葉片中存在TMV。Yuan等（2015）報道了幾種在接種TMV后表現為無癥狀的野生煙草，包括Ⅳcavicola（PI 271990）、N.glauca（PI 282690）、N.noctiflora（PI 417918）、N.af-ricana（PI 555472）、N.benavidesii（PI 555477）和N.raimondii（PI 555549）。這種無癥狀表型可看成一種抗病反應，有的文獻將T1203和Ambalema等無癥狀資源視為抗TMV資源（Beekwilder，1999）。胡群（2016）研究表明，T1203等煙草品種對TMV的無癥狀表型是由兩個拷貝的隱性基因控制，控制無癥狀基因的克隆可促進此類資源在育種中的利用。[本研究切入點]T1203是我國引進的高抗TMV種質資源，其對TMV侵染表現無癥狀，可應用于煙草的抗TMV育種。雖然前人對無癥狀煙草種質資源已有一些研究，但針對T1203資源的系統研究未見文獻報道。[擬解決的關鍵問題]通過TMV接種、病情調查、病毒外殼蛋白累計量檢測、TMV復制水平測定及日灼現象觀察等探究煙草種質資源T1203的TMV抗性特點，以期為煙草抗病育種的親本選擇提供更豐富的信息。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試煙草品種：T1203（無癥狀表型品種）、Coker176（高抗品種）、K326（普通煙對照）和中煙100（感病對照）。毒源：TMV-U1株系（TMV-U1）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）和表達GFP的TMV侵染性克隆。

1.2試驗方法

1.2.1病毒接種與病情調查 在溫室內按常規方法漂浮育苗，苗齡50d左右，在小花盆中每份定植18株，每盆1株，采用棉簽摩擦接種病毒。具體方法：采集經免疫檢測試紙條檢測無污染的毒源新鮮病葉，于無菌研缽中用接種緩沖液（0.01mol/LpH7.0磷酸鹽緩沖液）研磨，雙層紗布過濾，調整接種液濃度為1：100（重量體積比，g/L），在病毒汁液中加入過0.075mm篩孔的1%SiO₂；用棉簽取病葉汁液，每株摩擦接種2片葉。接種后第5和7d以株為單位調查接種葉是否有枯斑；接種后10、14、21、28、35和40d調查花葉等癥狀發生情況。

試紙條檢測法：采用Agdia公司（www.agdia.com）的TMV檢測試紙條（Imuno-strip）進行檢測，方法參考試劑說明書。

1.2.2病毒外殼蛋白累計量檢測 參照于翠（2004）的方法，利用TMV和CMV的外殼蛋白單克隆抗體，檢測接種病毒后煙草葉片中的病毒外殼蛋白累積量。

1.2.3TMV復制水平測定 參照Donson等（1991）的方法，將表達GFP的TMV侵染性克隆導人農桿菌菌株EHAl05，將農桿菌稀釋500倍浸潤接種5葉期的普通煙對照K326和T1203下部葉片，并在熒光顯微鏡下觀察浸潤葉片重組病毒中GFP的表達情況。參照Yu等（2004）的方法分別制備T1203和K326的葉片原生質體細胞，利用TMV侵染性體外轉錄本，通過電極法轉染原生質體，2d后Trizol法提取原生質體總RNA，設計TMV特異性引物進行熒光定量反轉錄PCR（qRT-PCR）測定TMV基因組復制水平；以煙草Actin基因為內參基因。

1.2.4日灼現象觀察 常規方法田間移栽T1203和K326，每份材料移栽20株。觀察煙草植株的生長情況及葉片在強日照天氣下是否出現萎蔫和枯死。

2結果與分析

2.1T1203接種TMV后葉片癥狀及病毒檢測結果

塑料大棚內盆栽T1203、Coker176、K326和中煙100苗期接種TMV-U1株系，高抗TMV的枯斑資源Cokerl76在接種5d后其接種葉片表現枯斑，持續調查至接種后40d，非接種葉無癥狀（表1）；K326和中煙100接種后14d開始表現典型花葉，接種后第28d植株明顯矮化（圖1），接種40d后上部非接種葉表現典型花葉、畸形和矮化等癥狀（圖2）；T1203接種TMV后14d葉片無癥狀表現，接種后28d亦無花葉、畸形和矮化等癥狀，上部非接種葉TMV免疫試紙條檢測為TMV陽性，接種后第40d非接種葉表現輕微的黃色斑駁（表1、圖1和圖2）。

2.2抗性特異性檢測及病毒外殼蛋白積累量檢測結果

為檢驗T1203是否對侵染煙草的PVY和CMV表現癥狀，在光照培養室內分別采用摩擦接種TMV、PVY和CMV，結果顯示，接種TMV后14d，對照普通煙K326全部表現花葉，T1203無癥狀；接種PVY和CMV后14d，K326和T1203均表現明顯的花葉、葉片狹窄等典型癥狀（未列出圖片）。表明T1203對TMV的無癥狀表型具有特異性。

光照培養室內接種后14d，利用TMV單克隆抗體對非接種葉片的TMV外殼蛋白（CP）積累量進行檢測，結果表明，T1203葉片中TMV-CP含量明顯低于對照K326；利用CMV單克隆抗體對非接種葉片的CMV外殼蛋白（CP）積累量進行檢測，結果表明，T1203葉片中CMV-CP含量與對照K326相當（圖3）。非接種葉病毒外殼蛋白積累量檢測結果顯示，光照培養室內接種后14d，T1203葉片中TMV病毒積累量較對照K326低，與無癥狀表型吻合；T1203葉片中CMV病毒積累量與對照K326相當，與花葉癥狀表型吻合（未列出圖片）。

2.3TMV復制水平測定結果

為明確T1203抗TMV的機理，利用表達GFP的TMV侵染性克隆分析抗性發生水平，該侵染性克隆不能系統侵染普通煙，僅可在浸潤細胞內復制（Don-son et a1.，1991）。表達GFP的TMV侵染性克隆浸潤接種7和10 d后，K326的浸潤葉可觀察到離散的綠色熒光，而T1203浸潤葉未觀察到綠色熒光（圖4），說明T1203對TMV的抗性水平發生在病毒復制水平。利用TMV侵染性體外轉錄本，通過電極法轉染原生質體，然后通過定量PCR測定原生質體中TMV負鏈基因組RNA積累水平，結果發現T1203原生質體中TMV的復制量僅為K326的20%（圖5），進一步驗證T1203對TMV的抗性發生在病毒復制水平。

2.4日灼現象觀察結果

T1203在25℃以上的強光照射下，生長迅速的上部新展開葉易發生日灼現象，表現為葉片上部萎蔫，隨后萎蔫部位枯死。K326等感TMV對照品種偶爾表現上部葉片萎蔫的日灼癥狀，但萎蔫癥狀大部分能恢復（圖6）。

3討論

近年來，針對T1203等無癥狀資源的研究較少。陳海如和范靜華（1991）研究了病毒在T1203不同葉齡葉片中的分布情況，胡群（2016）對控制T1203無癥狀表型的基因進行研究，而本研究通過TMV病毒接種、病情調查、病毒外殼蛋白累計量檢測、TMV復制水平測定及日灼現象觀察等分析T1203對TMV的抗性特異性、T1203接種TMV普通株系（TMV-U1株系）后的癥狀、病毒復制水平等，更系統地探究了煙草種質資源T1203抗TMV的特點，為煙草抗病育種的親本選擇提供了更豐富的信息。

本研究苗期接種試驗結果顯示，T1203接種TMV-U1株系早期（接種后28d內）葉片無枯斑、花葉和斑駁等明顯癥狀，因此被稱為無癥狀抗病類型。T1203接種TMV-U1株系的無癥狀表型受接種后時間、光照和溫度等影響，接種后28d內T1203表現為無癥狀；接種后28d開始，在較高溫度和光照條件下，T1203幼嫩葉片表現輕微的黃色斑駁癥狀，但煙株無花葉、畸形和矮化等癥狀。與感病的K326典型TMV癥狀相比較，T1203的癥狀輕微，K326未感染TMV的煙株幼嫩葉片有時也表現輕微的黃色斑駁，因此，由于肉眼觀察的局限性，T1203接種后期幼嫩葉片輕微的黃色斑駁癥狀可能被忽視。本研究結果表明，T1203的無癥狀現象對TMV具有特異性，對PVY和CMV無此現象發生。Chaplin和Gooding（1 969）發現T125、T1383、T1384、T1407、T1410、T1411、T1412、T1413、T1436、T1437、T1438、T1439、T1448、T1448A、T1449、T1450、T1465、T1468、T1470、T1471、T1692、T11203和T11467等25份煙草資源對TMV表現無癥狀，這些資源被稱為Ambalema類抗TMV資源。胡群（2016）研究表明，T1203對TMV的無癥狀表型由2個拷貝的隱性基因控制，且T1203非接種葉片中的TMV含量較低。病毒復制水平低和病毒移動出接種葉受阻均可導致非接種葉中病毒含量低。本研究病毒侵染性克隆浸潤接種、原生質體病毒RNA含量檢測結果表明，非接種葉病毒含量低很可能發生在病毒復制水平。鑒于接種TMV表現無癥狀的資源葉片內存在較低濃度的TMV，建議將此類資源稱為耐病資源（Disease tolerance），以便與常見的抗病性相區分。

研究中發現T1203較K326等對照易發生日灼現象。Valleau（1952）研究發現Ambalema有隱癥現象，高溫時也會出現日灼現象，且難以恢復；Nolla和Roque等（1933）研究發現Ambalema接種TMV后有空莖現象，但是否屬于隱癥現象的并發癥還有待進一步研究。

T1203接種TMV后，前期表現為無癥狀且葉片病毒累積量低、后期非接種幼葉表現輕微的黃色斑駁癥狀、高溫和強日照條件下容易出現不可恢復的日灼現象，這些特點限制了T1203這類無癥狀資源作為抗TMV資源的育種利用。

4結論

本研究結果表明，煙草種質資源T1203只對TMV表現無癥狀的抗病特點，接種PVY和CMV表現典型感病癥狀，且T1203對TMV的抗性發生在病毒復制水平。在高溫和強日照條件下，T1203生長迅速的中上部葉片會發生日灼現象，且難以恢復。

（責任編輯麻小燕）