豬血抗凝劑的篩選與抗凝條件優(yōu)化研究

章斌 侯小楨 楊勝遠(yuǎn) 黃諾恩

摘要[目的]篩選抗凝劑配方并優(yōu)化抗凝條件。[方法]以新鮮豬血液為試材，以血液黏度、血紅蛋白OD414nm值、血紅細(xì)胞數(shù)量為指標(biāo)，研究添加不同抗凝劑后的豬血理化與生化特性。[結(jié)果]抗凝效果最佳的抗凝劑組合與條件為檸檬酸鈉100%，pH 9.19，添加量6 g/L，4 ℃冷藏保存；或六偏磷酸鈉100%，pH 1.76，添加量4 g/L，常溫或4 ℃保存。[結(jié)論] 對(duì)比該試驗(yàn)與他人研究結(jié)果，選用單一或復(fù)合型抗凝劑有待進(jìn)一步探討。

關(guān)鍵詞豬血；抗凝劑；抗凝條件

中圖分類號(hào)S879.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）12-0076-03

Abstract[Objective] To screen and optimize the anticoagulant formula and condition. [Method] Taking fresh pig blood as test material and blood viscosity， OD414nm value as well as blood cell count as main indexes， physicochemical and biochemical characteristics of pig blood with addition of different anticoagulants were measured. [Result] Conditions and formula with best anticoagulant effect was 100% of sodium citrate， pH 9.19， adding amount 6 g/L and stored in 4 ℃， or sodium hexametaphosphate 100%， pH 1.76， adding amount 4 g/L and stored at room temperature or in 4 ℃. [Conclusion] Comparing experiments results got in this paper with others， using single or compound anticoagulant needs further study.

Key wordsPig blood；Anticoagulant；Anticoagulant conditions

伴隨肉類加工業(yè)的快速發(fā)展，隨之產(chǎn)生的畜禽血液數(shù)量巨大，僅豬血每月就可采集12萬(wàn)t[1]；而目前豬血的加工利用水平相對(duì)較低，除少量用于制備蛋白飼料外[2]，大部分直接排放，浪費(fèi)資源，污染環(huán)境。據(jù)有關(guān)調(diào)查顯示，豬全血中蛋白質(zhì)含量18.9%，比雞蛋高6.2%，比大米高12.7%。豬全血蛋白質(zhì)中含18種氨基酸，包括8種必需氨基酸和2種半必需氨基酸；其中賴氨酸含量高達(dá)14.1%，是肉、乳、蛋含量的2倍[3]。另外，豬血漿富含大量功能性蛋白質(zhì)，如白蛋白、免疫球蛋白、纖維蛋白原及凝血酶等；除此之外，豬血還含有多種生物酶、低分子氨化物、葡萄糖、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，研究并優(yōu)化豬血抗凝劑，對(duì)高值化利用豬血及其產(chǎn)品加工有較強(qiáng)的實(shí)際意義。

目前，較常用的抗凝劑有肝素鈉、EDTA、草酸鹽、氟化鈉、檸檬酸鈉[4]。郭晉育等[5]比較了4種豬血抗凝劑的抗溶血效果，其研究結(jié)果表明，由25%檸檬酸鈉、25%三聚磷酸鈉、25%山梨糖醇、5%食鹽、20%EDTA-2Na組成的復(fù)合抗凝劑在濃度15%、添加比例4.5‰條件下效果較好。施劉翠等[6]在2種磷酸鈉鹽對(duì)新鮮豬血抗凝特性影響的試驗(yàn)研究中得出，添加0.6%六偏磷酸鈉和0.8%以上焦磷酸鈉，可獲得較佳的原血抗凝效果。筆者對(duì)比7種常用的單一或復(fù)合抗凝血?jiǎng)┎⑦M(jìn)行適宜組合篩選，旨在為畜禽血液抗凝血?jiǎng)┡浞脚c條件優(yōu)化提供試驗(yàn)參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及主要試劑。新鮮豬血，取自潮州市肉類聯(lián)合加工廠有限公司；主要試劑有檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸二氫鈉、六偏磷酸鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸鈉、三聚磷酸鈉、山梨糖醇、食鹽、EDTA-2Na。

1.1.2主要儀器設(shè)備。TGL-16gR型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；NDJ系列數(shù)顯黏度計(jì)，上海方瑞儀器有限公司；PHSJ-3F型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；JY3002型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；血球計(jì)數(shù)板，上海市求精生化試劑儀器有限公司；B204型學(xué)生數(shù)碼顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1抗凝血?jiǎng)┙M合確定。

組合1（A），檸檬酸10.19%、檸檬酸鈉 81.98%、磷酸二氫鈉 7.82%；

組合2（B），檸檬酸26.67%、檸檬酸鈉 73.33%；

組合3（C），檸檬酸鈉 100%；

組合4（D），檸檬酸2.63%、檸檬酸鈉 19.71%、六偏磷酸鈉 12.35%、氯化鈉 65.31%；

組合5（E），檸檬酸2.63%、檸檬酸鈉 19.71%、磷酸二氫鈉 12.35%、氯化鈉 65.31%；

組合6（F），六偏磷酸鈉100%；組合7（G），檸檬酸鈉25%、三聚磷酸鈉25%、山梨糖醇25%、食鹽5%、 EDTA-2Na 20%。

準(zhǔn)確稱取上述抗凝血?jiǎng)┙M合各2.50 g，用蒸餾水定容至25 mL，測(cè)定pH；再分別與475 mL新鮮豬血充分混合（即抗凝血?jiǎng)┦褂昧繛? g/L），于室溫和4 ℃下保存24和48 h后觀察抗凝效果。

1.2.2指標(biāo)測(cè)定。選取添加“1.2.1”各抗凝血?jiǎng)┙M合后不產(chǎn)生凝結(jié)的豬血為對(duì)象，測(cè)定如下指標(biāo)：①血液黏度測(cè)定。采用NDJ系列數(shù)顯黏度計(jì)測(cè)定。②血紅蛋白OD414nm值。量取20 mL豬血，于4 000 r/min離心10 min后取血漿液，用生理鹽水稀釋至10倍，于414 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。③血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。取一定量的新鮮豬血于4 ℃、4 000 r/min條件下高速冷凍離心20 min，然后去血漿收集血紅球，加入約1倍體積的A～G抗凝血?jiǎng)瑪嚢杌靹蚝笤儆? ℃、4 000 r/min條件下離心20 min，去上清液取沉淀，即得血紅細(xì)胞；用計(jì)數(shù)板對(duì)血紅細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1抗凝劑配方優(yōu)選

2.1.1抗凝劑pH測(cè)定和抗凝效果描述。

不同抗凝劑引起的豬血液混合體系pH變化較大，對(duì)豬血所含成分的穩(wěn)定性會(huì)產(chǎn)生不同的影響，如豬血含豐富的血紅蛋白等成分，這些蛋白成分易在等電點(diǎn)范圍發(fā)生沉集凝固而使豬血結(jié)塊凝固。該試驗(yàn)測(cè)得“1.2.1”所配制的7種抗凝劑A～G pH結(jié)果依次為5.46、4.84、7.69、4.94、4.96、2.48、8.55，其對(duì)豬血的相應(yīng)抗凝效果如表1所示。

從表1可看出，組合C、F在常溫和冷藏條件下的抗凝效果均最佳，其次為抗凝劑B、D、G在常溫下和抗凝劑D、G在4 ℃也表現(xiàn)出較好的抗凝效果；而加入A、E組合抗凝劑的豬血凝結(jié)現(xiàn)象嚴(yán)重，不列為抗凝劑篩選組合。同時(shí)，結(jié)合各抗凝劑測(cè)定結(jié)果，進(jìn)一步優(yōu)化抗凝劑C、F的pH并觀察其抗凝效果，結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可看出，對(duì)于添加抗凝劑并于常溫條件貯放的豬血而言，抗凝劑F在pH 1.76～3.76范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的抗凝效果，且pH 1.76時(shí)的效果最佳；抗凝劑C在pH 9.19時(shí)表現(xiàn)出較好的抗凝效果。另一方面，對(duì)于添加抗凝劑并于4 ℃貯放的豬血而言，抗凝劑F和抗凝劑C分別在pH 1.26、8.69時(shí)有較好的抗凝效果。因此，該試驗(yàn)確定抗凝劑C的最佳pH為9.19，抗凝劑F的最佳pH為1.26。

2.1.2抗凝劑對(duì)血液黏度的影響。黏度是流體黏滯性的一種量度和流體流動(dòng)力對(duì)其內(nèi)部摩擦現(xiàn)象的直觀反映。在“2.1.1”試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，對(duì)常溫和冷藏條件抗凝效果較好的豬血進(jìn)行黏度測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，在常溫和4 ℃條件下，添加抗凝劑C的豬血黏度最低，抗凝效果最佳；抗凝劑F對(duì)4 ℃貯放的豬血同樣也表現(xiàn)出較好的抗凝效果。

2.1.3抗凝劑對(duì)血紅蛋白OD414 nm值的影響。對(duì)“2.1.1”中常溫和冷藏條件下抗凝效果較好的豬血進(jìn)行血紅蛋白的吸光度值測(cè)定，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，常溫和4 ℃條件貯放的豬血，添加抗凝劑C所分離的血紅蛋白OD值最低，其次為添加抗凝劑F。

2.1.4抗凝劑對(duì)血紅細(xì)胞數(shù)量的影響。由表5可見(jiàn)，常溫和4 ℃條件貯放的豬血，添加抗凝劑C、F、G的豬血血紅細(xì)胞數(shù)量最多，其他幾種抗凝劑影響差異不大。綜合上述不同抗凝劑對(duì)豬血貯放狀態(tài)、豬血液的黏度值、血紅蛋白OD414 nm值、血紅細(xì)胞數(shù)量分析，該試驗(yàn)選擇C、F為適宜抗凝劑。

2.2抗凝劑添加量對(duì)抗凝效果的影響在“2.1”試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察抗凝劑C、F的添加量對(duì)豬血常溫和4 ℃的抗凝效果，結(jié)果見(jiàn)表6。

從表6可看出，添加6 g/L的抗凝劑C對(duì)貯放于常溫和4 ℃的豬血總體表現(xiàn)出較好的抗凝效果；而添加4和6 g/L的抗凝劑F對(duì)貯放于常溫和4 ℃的豬血總體表現(xiàn)出較好的抗凝效果。

3結(jié)論

根據(jù)抗凝劑加入豬血后的現(xiàn)象，以及豬血黏度值、OD值和血紅細(xì)胞數(shù)量的綜合分析，抗凝劑C在pH 9.19、添加量6 g/L、4 ℃保存條件下，表現(xiàn)出較好的抗凝效果；抗凝劑F在pH 1.76、添加量4 g/L、常溫和4 ℃保存條件下，對(duì)豬血有較好的抗凝效果。郭晉育等[5]的研究表明，復(fù)合型抗凝劑較單一化合物有更好的抗凝血效果，該試驗(yàn)研究與其結(jié)論存在較明顯差異，可能受到豬血本身的新鮮程度、貯放環(huán)境條件等客觀因素所限，還有待進(jìn)一步探討。

豬血與抗凝劑混合體系的pH對(duì)豬血中血紅蛋白等蛋白成分的存在狀態(tài)有較大影響，從而對(duì)豬血凝結(jié)與否有較直接的作用。該研究?jī)H在特定的幾組抗凝劑范圍內(nèi)開(kāi)展了抗凝效果和條件研究，適于豬血抗凝的配方與條件需做進(jìn)一步篩選。

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