微波輻照對蠶豆種子萌發、花粉發育及農藝性狀的影響

黃雅琴

摘要：[目的]分析微波輻照對蠶豆種子萌發、花粉發育及農藝性狀的影響，明確微波輻照對植物的輻射效應，為微波輔助作物育種提供理論參考。[方法]分別以0（對照，CK）、5、10、15、20、25和30s微波爐輻照處理蠶豆干種子，分析不同微波輻照時間對蠶豆的種子萌發、花粉發育及農藝性狀的影響。[結果]微波輻照處理的蠶豆種子發芽勢和發芽率均隨著輻照時間的延長呈先上升后下降的變化趨勢，說明適當的微波輻照能促進種子萌發。微波輻照處理的蠶豆花粉母細胞在減數分裂Ⅰ期和Ⅱ期均能觀察到6種類型的染色體畸變，且隨著輻照時間的延長，染色體畸變類型增多，染色體總畸變率升高，表明輻照時間和染色體畸變呈顯著正相關（r=0.8432）（P<0.05，下同）。微波輻照的蠶豆花粉可育率隨著輻照時間的延長呈逐漸下降趨勢，表明微波輻照阻礙花粉正常發育，微波輻照時間與花粉可育率呈顯著負相關（r=-0.9066）。微波輻照5、10和15s的蠶豆株高、節數、葉面積和單株葉片數目與CK均無顯著差異（P>0.05）；微波輻照20s的蠶豆株高和單株葉片數目均顯著高于CK；微波輻照25s的蠶豆株高顯著高于CK，葉面積顯著低于CK；微波輻照30s的蠶豆葉面積極顯著低于CK，單株葉片數目顯著低于CK。即微波輻照20s能促進蠶豆植株長高，增加單株葉片數，但輻照時間進一步延長，株高、葉面積和單株葉片數又逐漸降低。[結論]微波輻照是一種有效的選育手段，適當微波輻照能提高蠶豆種子的萌發率，改善蠶豆的農藝性狀。但微波輻照能誘發蠶豆花粉母細胞在減數分裂過程中發生染色體畸變，導致花粉敗育。

關鍵詞：蠶豆；微波輻照；發芽率；減數分裂；染色體畸變；農藝性狀

中圖分類號：S643.603.6 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）11-1948-06

0引言

[研究意義]微波輻射是一種低能電磁輻射，可引起生物體的系統損傷與紊亂（Wang et a1.，2012；Westhoff et a1.，2013），誘發植物數量l生狀變異，輔助作物育種（方興等，1994；賈紅華等，2003；Garai-Vrhovac et a1.，2009）。應用微波輻射技術可創造出新材料與新種質，以彌補常規育種方法的不足，且不存在安全隱患（朱宗文等，2010），但研究微波輻射對作物產生的影響是首要工作，對新品種選育具有重要意義。[前人研究進展]至今，已有大量研究證實，蠶豆的染色體對外界各種致突變因子非常敏感，可引起染色體嚴重畸變（Ghatnekar，1964；Dimeska eta1.，2010；Sharma et a1.，2009；歐陽裕元等，2016），導致農藝性狀改變。湯澤生等（1980）、Sharma等（2009）研究表明，隨著輻射劑量的增加，蠶豆花粉母細胞減數分裂過程中染色體畸變率升高。華勁松等（2005）以⁶⁰Co-γ射線處理蠶豆干種子，發現蠶豆M₁代的生育期、生物學性狀和光合生理均有明顯影響。王昆林等（2008）以激光輻射蠶豆根尖細胞，導致根尖細胞有絲分裂活性增強，染色體結構發生變異。羅蔚華等（2012）以微波輻射蠶豆，結果發現隨著輻射時間的延長，微核率及染色體畸變率逐漸升高。胡旭群等（2015）通過⁶⁰Co-γ射線對大粒鮮食蠶豆進行誘變，有效改善了原始品種的農藝性狀。[本研究切入點]目前，關于微波輻射對蠶豆的誘變效應研究主要集中在根尖有絲分裂方面（劉文魁和王鳳，1994；羅蔚華等，2012），僅證實其可引起根尖細胞發生變異，但生殖細胞是否發生變異尚不清楚。[擬解決的關鍵問題]以微波輻照蠶豆種子，分析不同輻照時間對蠶豆種子萌發、花粉發育及農藝性狀的影響，為研究微波輻照的生物學效應及誘變育種提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試蠶豆購自信陽市東關農貿市場，大小勻稱，色澤一致，無病蟲害。微波源為格蘭仕微波爐[型號G70D20CN1L-M1（S0）]，額定電壓額定功率220 V-0 Hz，微波1180 w，額定微波頻率2450 MHz。

1.2試驗方法

1.2.1微波輻照處理 將蠶豆干種子分成7組，每組50粒，分別用微波爐輻照處理0（對照，CK）、5、10、15、20、25和30s，每組3次重復。

1.2.2種子萌發 將微波輻射照處理的7組蠶豆種子消毒后浸泡1d，以胚根突破種皮為發芽標準，于第3d計算發芽勢（第3d發芽種子數占供試種子數的百分率），第7d發芽試驗結束后，統計發芽率（最終發芽種子數占供試種子數的百分率）。

1.2.3染色體畸變觀察 將發芽的蠶豆苗種植于試驗田中，進行常規田間管理。待其長出花蕾，采集減數分裂旺盛的幼嫩花蕾，按照常規方法固定漂洗，以改良卡寶品紅染液染色3～5min，分散壓平后置于顯微鏡下觀察染色體畸變情況，每處理組至少觀察1000個減數分裂Ⅰ期和Ⅱ期細胞，同時進行記錄及拍照。常見的染色體畸變有微核、染色體橋、染色體斷片、落后染色體、染色體環和不均等分裂共6種類型。各類型染色體畸變率均以發生該類型染色體畸變的細胞數占該分裂期細胞總數的百分率表示，染色體總畸變率以所有發生染色體畸變的細胞總數占該分裂期細胞總數的百分率表示。若一個細胞中出現了多種畸變類型則重復計數。

1.2.4花粉育性檢測 用碘-碘化鉀溶液（I₂-IK）對成熟期花粉進行染色，檢測花粉育性，每處理組至少觀察1000個花粉細胞。可育花粉呈橢球形，能被I₂-IK染成黑褐色，不育花粉形狀不規則，不著色。花粉可育率以可育花粉數占所觀察花粉總數的百分率表示。

1.2.5農藝性狀的測定 分別用米尺和游標卡尺測量植株的株高、葉片長和寬，統計單株葉片數和節數，計算葉面積。葉面積計算公式為：葉面積=長×寬×π×1/4。

1.3統計分析

利用SPSS13.0對試驗數據進行t檢驗，分析差異顯著性。

2結果與分析

2.1微波輻照對蠶豆種子萌發的影響

由圖1可知，CK的發芽勢明顯低于發芽率，表明蠶豆的種皮較厚實，發芽速度慢，不整齊。微波輻照處理的蠶豆種子發芽勢和發芽率均隨著輻照時間的延長呈先上升后下降趨勢，說明適當的微波輻照能軟化種皮，促進種子萌發，但過度輻照，微波穿透種皮到達種胚，損傷加劇，阻礙種子萌發。微波輻照5～20s時，發芽勢等于發芽率，進一步證實微波輻照能促進種子萌發；微波輻照15s時，蠶豆種子的發芽勢和發芽率均達最大值（100%）；微波輻照20s時，發芽勢和發芽率均開始降低；微波輻照30s時，發芽勢和發芽率均為最小值，且低于CK，表明微波輻照時間與蠶豆種子萌發密切相關。

2.2微波輻照對蠶豆花粉母細胞減數分裂的影響

對微波輻照處理的蠶豆花粉母細胞進行觀察，結果發現，在減數分裂Ⅰ期和Ⅱ期均能觀察到微核、染色體橋、染色體斷片、落后染色體、染色體環和不均等分裂等6種染色體畸變類型（圖2和圖3）。對各類型的染色體畸變率進行統計，結果如表1和表2所示。在減數分裂Ⅰ期，CK的染色體總畸變率較低（0.52%），微波輻照5、10和15s時，分別出現3-4種染色體畸變類型，染色體總畸變率與CK無顯著差異（P>0.05，下同）；微波輻照20s時，出現4種染色體畸變類型，染色體總畸變率顯著高于CK（P<0.05，下同）；微波輻照25和30s時，分別出現6種染色體畸變類型，染色體總畸變率極顯著高于CK（P<0.01，下同）。在減數分裂Ⅱ期，微波輻照5和10s時，分別出現3-4種染色體畸變類型，染色體總畸變率與CK差異不顯著；微波輻照15s時，出現5種染色體畸變類型，染色體總畸變率顯著高于CK；微波輻照20、25和30s時，分別出現6種染色體畸變類型，染色體總畸變率極顯著高于CK，且在一個細胞內同時有2種或2種以上的染色體異常現象出現（圖2-F和圖3一G）。綜上所述，微波輻照會造成花粉母細胞減數分裂Ⅰ期和Ⅱ期的染色體發生異常，隨著輻照時間的延長，染色體畸變類型增多，染色體畸變率升高，兩者呈顯著正相關（r=0.8432）。

2.3微波輻照對蠶豆花粉育性的影響

各組的蠶豆花粉經染色后表現出不同的育性，如圖4所示，可育花粉呈橢球形，被I₂-1K染成黑褐色，不育花粉形狀不規則，不著色。由表3可知，微波輻照后蠶豆花粉可育率隨著輻照時間的延長呈逐漸下降趨勢。與CK相比，微波輻照20s時花粉可育率顯著下降6.17%，微波輻照25和30s時分別極顯著下降15.68%和23.07%。表明微波輻照會阻礙花粉正常發育，最終導致敗育。因此，微波輻照時間與花粉可育率呈顯著負相關（r=-0.9066）。

2.4微波輻照對蠶豆農藝性狀的影響

對微波輻照處理蠶豆植株的農藝性狀進行觀察測定，結果如表4所示。微波輻照5、10和15s的蠶豆株高、節數、葉面積和單株葉片數目與CK均無顯著差異。微波輻照20、25和30s的蠶豆株高、葉面積和單株葉片數與CK存在明顯差異，其中，微波輻照20s的蠶豆株高和單株葉片數均顯著高于CK；微波輻照25s的蠶豆株高顯著高于CK，葉面積顯著低于CK；微波輻照30s的蠶豆葉面積極顯著低于CK，單株葉片數顯著低于CK。表明微波輻照20s能促進蠶豆植株長高，增加單株葉片數，隨輻照時間進一步延長，株高、葉面積和單株葉片數又逐漸降低。

3討論

微波能穿透生物組織，增加分子運動，產生熱效應，引起細胞的氧化應激反應（Kalns et a1.，2000；Kim and Rhee，2004；滿其航等，2010；王小華等，2016）和DNA損傷（Garai-Vrhovac and Orescanin，2009）。此外，微波輻照可造成生殖系統損傷（牟敬鋒和嚴宙寧，2013），導致精子畸形（Goud et a1.，1982）。本研究結果也表明，微波輻照造成花粉母細胞減數分裂過程中染色體畸變，最終導致花粉敗育。前人研究發現，以不同的物理和化學誘變劑處理蠶豆，在減數分裂過程中易出現染色體橋、染色體斷片、染色體環、微核等染色體畸變類型（Ecochard，1966；Sharma et a1.，2009）。這些畸變在本研究中也觀察到，表明采用不同的誘變方法可獲得相似的誘變效應。

本研究結果表明，微波輻照5和10 s時減數分裂Ⅰ期和Ⅱ期染色體總畸變率與空白對照無顯著差異。羅蔚華等（2012）用微波爐輻照蠶豆，試驗設計與本研究相同，結果在根尖細胞有絲分裂過程中也觀察到多種染色體畸變類型，但微波輻照處理組的微核率和染色體總畸變率均顯著高于對照。將本研究與羅蔚華等（2012）的研究進行對比，結果發現相同時間的微波輻照處理下，減數分裂染色體總畸變率均低于有絲分裂染色體總畸變率。推測其原因是微波輻照蠶豆后先生根，即輻照損傷先在根尖細胞中表現，隨著植株生長，在體內中畸變細胞與正常細胞互相競爭，畸變細胞逐漸處于落后狀態，被正常細胞所代替，最終死亡，植株體細胞的輻射損傷逐漸減輕并趨于正常，小孢子母細胞起源于體細胞，在生殖生長期發育，因此減數分裂染色體總畸變率低于有絲分裂染色體總畸變率。

本研究對微波輻照處理的蠶豆種子發芽勢和發芽率進行分析，結果發現適當的微波輻射能促進種子萌發。這與楊俊紅等（2003）、張淑卿等（2011）的研究結論相一致。本研究還發現，微波輻照20s能促進蠶豆植株長高，增加單株葉片數目，對蠶豆育種具有重要意義，但微波輻照對蠶豆植株其他農藝性狀的影響有待進一步研究。

4結論

微波輻照能誘發蠶豆花粉母細胞在減數分裂過程中發生染色體畸變，導致花粉敗育。適當微波輻射能提高蠶豆種子的萌發率，改善蠶豆的農藝性狀。

（責任編輯陳燕）