木薯海藻糖合成酶基因MeTPS6克隆及其在非生物脅迫下的表達分析

丁澤紅　鐵韋韋　付莉莉　顏彥　胡偉

摘要：[目的]克隆木薯海藻糖合成酶基因MeTPS6，并分析其在干旱、低溫、遮蔭等非生物脅迫應答中的表達情況，為研究TPS因功能及抗逆分子機理提供參考。[方法]采用RT-PCR從木薯中克隆MeTPS6基因，并進行生物信息學分析及構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。采用熒光定量PCR（qPCR）分析MeTPS6基因在干旱、低溫和遮蔭脅迫下不同木薯品種不同組織中的表達特性及模式。[結果]克隆獲得的MeTPS6基因具有一個2565 bp的開放閱讀框，編碼854個氨基酸，含有TPS家族保守結構域（Glyco_transf_20）。MeTPS6蛋白與楊樹（Potri.010G104500）和杞柳（SapurV1A.0015s0610）同源蛋白氨基酸序列的相似性分別達92.6%和90.0%，表明木薯與楊樹和杞柳的親緣關系較近。MeTPS6～因的啟動子序列中存在大量非生物脅迫相關元件（低溫相關元件LTR、干旱相關元件MBS等）、激素相關元件（脫落酸相關的元件ABRE～ICE3、水楊酸相關元件TCA-element～）及光響應相關元件（ACE、Box I等）。MeTPS6基因在木薯儲藏根中的表達量最高，須根次之，二者均顯著高于莖、葉柄和葉片中的表達量（P<0.05，下同），且在干旱、低溫和遮蔭脅迫下，不同組織中的表達模式存在明顯差異。對于不同木薯品種，干旱、低溫和遮蔭脅迫處理均顯著誘導其MeTPS6基因表達。在高置信度（confidence=0.8）的情況下，共找到13個共表達基因，其中有10個為TPS同源基因，表明這些同源基因可能相互協(xié)調(diào)，共同參與植物生物學過程；另外3個基因（CAT、CAT1和F5M15.5）均編碼過氧化氫酶，主要參與保護細胞免受過氧化氫的毒性作用。[結論]MeTPS6基因主要在木薯的根（特別是儲藏根）中表達，并從轉錄水平參與干旱、低溫和遮蔭脅迫響應，可作為候選基因進一步研究其在木薯抗逆中的功能。

關鍵詞：木薯；海藻糖合成酶；MeTPS6基因；干旱；低溫；遮蔭；表達分析

中圖分類號：S533.034 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）11-1923-07

0引言

[研究意義]木薯（Manihot esculenta Crantz）屬于大戟科木薯屬塊根植物，其塊根富含淀粉，是熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟作物和糧食作物。木薯作為典型的熱帶作物，適應性強，耐旱耐瘠，但在低溫、長時間干旱或嚴重干旱條件下，其塊根產(chǎn)量大幅度減產(chǎn)甚至絕收（盧賽清等，2009；Okogbenin et a1.，2013）。此外，塊根產(chǎn)量還受遮蔭、耕作方式等因素的影響，如拉丁美洲等經(jīng)濟落后地區(qū)將木薯與其他作物（橡膠樹、玉米等）問作使其受到不同程度的遮蔭脅迫，其產(chǎn)量顯著減少（Okoli and Wilson，1986；Fu et a1.，2016）。海藻糖-6-磷酸合成酶（Trehalose-6-phosphate synthase，TPS）是海藻糖生物合成代謝的關鍵酶，在植物干旱、低溫等逆境脅迫中發(fā)揮重要作用（Li et a1.，2011；Yang et a1.，2012；Mu et a1.，2016）。因此，克隆木薯TPS相關基因并進行表達分析對深入研究其在木薯抗脅迫中的表達調(diào)控作用具有重要意義。[前人研究進展]海藻糖是由2個葡萄糖分子通過α-1，1糖苷鍵連接而成的非還原性雙糖，植物在干旱、低溫、氧化等脅迫下其大量積累，可保護蛋白質、核酸、生物膜等生物大分子物質，以增強植物的抗逆性（Garg et a1.，2002；郭蓓等，2008）。海藻糖合成包括兩步反應：一是由尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖在TPS的催化下生成6-磷酸海藻糖；二是6-磷酸海藻糖在海藻糖6-磷酸酯酶的水解作用下生成海藻糖（史健志等，2015）。可見，TPS是海藻糖生物合成途徑中的一個關鍵酶。經(jīng)研究證實，植物體內(nèi)TPS基因表達與海藻糖含量密切相關（Garg eta1.，2002；Li et a1.，2011）。目前，已從棉花（Kosmaset a1.，2006）、水稻（Li et a1.，2011）、茶樹（丁菲等，2012）、擬南芥（Delorge et a1.，2014）、壇紫菜（史健志等，2015）、堿茅（李瑩和柳參奎，2015）、辣椒（魏兵強等，2016）、香蕉（王安邦等，2016；邢文婷等，2017）等植物中克隆獲得TPS基因，并對其功能進行深入研究，結果表明非生物脅迫可誘導TPS基因表達，植物體內(nèi)海藻糖含量明顯升高。郭蓓等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，將擬南芥TPS基因轉入煙草后，轉基因煙草植株體內(nèi)海藻糖含量明顯增加，其耐受鹽脅迫的能力顯著增強。Garg等（2002）、Li等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，在干旱、低溫和高鹽條件下，轉OsTPS1基因水稻植株抗性均明顯增強，其植株體內(nèi)海藻糖含量是野生型的2倍。Kosmas等（2006）、Deng等（2014）研究表明，在干旱脅迫下，棉花GkTPS基因和海帶SiTPS基因的表達量顯著升高。丁菲等（2012）、魏兵強等（2016）研究表明，在低溫脅迫下，辣椒CaTPS基因和茶樹GsTPS基因的表達量均顯著升高。史健志等（2015）研究表明，在高溫和干旱脅迫下，壇紫菜PhTPS基因的表達顯著上調(diào)。Henry等（2014）研究表明，在遮蔭脅迫下，玉米TPS因的表達量發(fā)生顯著變化。此外，TPS因的表達量在同一植物不同組織中呈差異性表達（丁菲等，2012；魏兵強等，2016）。綜上所述，植物體內(nèi)TPS基因受干旱、低溫、遮蔭等脅迫誘導表達，通過提高其表達量可增強植株的抗逆性。[本研究切入點]目前尚未見有關木薯TPS因克隆及其在非生物脅迫下表達分析的研究報道。[擬解決的關鍵問題]克隆木薯TPS基因（MeTPS6），并采用熒光定量PCR（qPCR）檢測其在不同品種、同一品種不同組織及在干旱、低溫和遮蔭等脅迫下的表達特性，為研究MeTPS6基因功能及抗逆分子機理提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為木薯栽培品種Arg7和Ku50及野生種W14（M.esculenta ssp.Flabellifolia），來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所試驗基地。Arg7和Ku50是w14經(jīng)人工選擇與馴化獲得，其適應性和部分農(nóng)藝性狀均優(yōu)于W14，如Ku50的塊根產(chǎn)量和淀粉含量較高，抗逆性較好；Arg7適宜于高緯度地區(qū)生長，但抗旱性一般。主要試劑：RNA抽提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司]；cDNA反轉錄試劑盒購自Fermentas公司；SYBR Premix Ex Taq（SYBR Green I）試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。主要儀器設備：Mx 3005P熒光定量PCR儀（Stratagene，美國）。

1.2種植與脅迫處理

參照Ding等（2016）的方法種植木薯：將Ku50種莖切成10-15cm莖段，選擇粗細均勻且具有2～4個芽眼的莖段扦插于塑料盆（上直徑18.5cm，下直徑14.8cm，高18.5cm）中，每盆扦插1個莖段。木薯盆栽基質是由蛭石與營養(yǎng)土按照1：1（v/v）混合而成。種植10d后進行間苗，每盆保留1棵苗，用于脅迫處理。干旱脅迫處理：木薯種植60d后，挑選生長狀況基本一致的植株，施用20%PEG-6000溶液進行模擬干旱脅迫處理，以不施PEG-6000（澆自來水）的植株-為對照。于脅迫0、3和24h后分別采集未展開葉、第一片完全展開葉、老葉和根，液氮速凍后，于80℃保存?zhèn)溆茫坏蜏孛{迫處理：木薯種植60d后，挑選長勢基本一致的植株置于光照培養(yǎng)箱，于4℃條件下進行低溫脅迫處理。于脅迫0、6和24h后分別采集未展開葉、第一片完全展開葉和根，液氮速凍后，于-80℃保存?zhèn)溆茫徽谑a脅迫處理：將木薯種植于橡膠樹下進行遮蔭脅迫處理，以正常光照下種植的木薯為對照。種植60d后挑選長勢基本一致的植株，采集其未展開葉、第一片完全展開葉和老葉，液氮速凍后，于80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2015年夏季將W14、Ku50和Arg7的種莖（10～15cmK，含2～4個芽眼）分別種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院文昌試驗基地，株行距0.8m×1.0m，各30株，水肥管理與大田種植相同。種植90d后分別采集W14、Ku50和Arg7的葉片和根，用于qPCR檢測不同木薯品種不同組織中MeTPS6基因的表達情況；采集Ku50的葉片、葉柄、莖、須根和儲藏根，用于qPCR檢測同一品種不同組織中MeTPS6基因的表達情況。

1.3RNA提取及cDNA合成

參照RNA抽提試劑盒說明提取樣品總RNA，并使用cDNA反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物設計及合成

根據(jù)Phytozome木薯數(shù)據(jù)庫提供的TPS基因序列（cassava4.1001584m），采用Primer6.0設計引物，包括MeTPS6基因全長擴增引物（MeTPS6-F：5'-ATGGTGTCAAGGTCATACTCA-3'；MeTPS6-R：5'-TTACACTGCAACTGTTTGTTCT-3'）、MeTP$6基因qPCR引物（qMeTPS6-F：5'-TCTGGGGAGTCTCCATCGTT-Y：qMeTPS6-R：5-TGCCCTTATTGGCAGCTGA-3）和actin基因qPCR引物（qActin-F：5'-TGATGAGTCTGGTCCATCCA-3'；qActin-R：5'-CCTCCTACGACCCAATCTCA-3'）（Fu et a1.，2016）。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5基因克隆

以木薯葉片cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系50.0μL：cDNA模板1.0μL，2.5mmol/L dNTPs4.0μL，10xLA Buffer 5.0μL，5 U/μL LA Taq DNA聚合酶0.5μL，10μmol/L正、反向引物各1.0μL，ddH20補充至50.0μL。擴增程序：94℃預變性5.0min；94℃45s，50℃45s，72℃3.5min，進行35個循環(huán)；72℃延伸7.0min；25℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.6qPCR檢測

利用SYBR Premix EX Taq試劑盒在Mx 3005P熒光定量PCR儀上進行qPCR檢測。反應體系20.0μL：SYBR Green I 10.0μL，ROX 0.4μL，正、反向引物各0.4μL，cDNA模板2.0μL，ddH20補充至20.0μL。擴增程序：95℃預變性30s；95℃10s，55℃10s，72℃20s，進行40個循環(huán)。每個樣品重復3次，采用2法計算基因相對表達量（Fu et a1.，2016）。

1.7生物信息學分析

在Phytozome數(shù)據(jù)庫中利用BLASTp在線搜索MeTPS6基因的同源序列，利用ClustalX進行序列比對（Jeanmougin et a1.，1998），利用MEGA 5.2構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（Tamura et a1.，2011），利用ExPASyProtParam分析蛋白質的理化性質，利用Plant-mPLoc進行亞細胞定位預測，利用NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫分析蛋白質的保守結構域，利用PlantCARE分析啟動子元件，利用STRING數(shù)據(jù)庫構建基因共表達調(diào)控網(wǎng)絡。

1.8統(tǒng)計分析

采用Excel 2007進行統(tǒng)計和制圖，并以Duncan s進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1MerPS6基因克隆及序列分析結果

MeTPS6基因PCR擴增結果顯示，擴增條帶單一且清晰，長度約2500bp，與預期結果相符（圖1）。測序結果顯示，該序列長度為2565bp，編碼854個氨基酸。經(jīng)BLASTx比對分析，發(fā)現(xiàn)MeTPS6基因與擬南芥TPS基因的同源性最高（83.3%）。將MeTP$6基因序列提交至GenBank，登錄號為MF684374。MeTP$6基因與參考序列（cassava4.1 001 584m）的比對分析結果顯示，二者存在7個堿基差異，但均為同義突變。MeTPS6基因與基因組DNA序列的比對分析結果顯示，該基因含3個外顯子和2個內(nèi)含子。生物信息學分析結果顯示，MeTPS6基因編碼蛋白（MeTPS6）分子量為96860-4 Da，理論等電點（pI）為5.83，屬于不穩(wěn)定蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為45.76，定位于葉綠體，含有TPS家族保守結構域（GlyCO transf_20）（圖2）。

2.2系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結果

經(jīng)BLASTp同源序列比對，獲得與MeTPS6蛋白氨基酸序列同源性較高的其他物種蛋白氨基酸序列，并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖3）。結果顯示，這些同源蛋白可分為四大類：第1類包括水稻、高粱、狗尾草、柳枝稷、谷子和玉米，除水稻外均為C4物種，且水稻與柳枝稷親緣關系最近；第Ⅱ類包括琴葉擬南芥、鼠耳芥、擬南芥、薺菜花和白菜型油菜，均為十字花科的物種；第Ⅲ類包括木薯、楊樹和杞柳，木薯MeTPS6蛋白分別與楊樹（Potri.010G104500）和杞柳（SapurVlA.0015s0610）同源蛋白的氨基酸序列相似性分別達92.6%和90.0%，表明木薯與楊樹和杞柳的親緣關系最近；第Ⅳ類僅包括二穗短柄草，雖然二穗短柄草然也為C4物種，但其序列與其他C4物種存在明顯差異，故單獨聚為一類。

2.3MeTPS6基因啟動子元件分析結果

啟動子是基因的重要組成部分，調(diào)控著基因轉錄的起始時間和表達水平。本研究選取MeTPS6基因起始密碼子上游1500bp進行啟動子元件分析，結果發(fā)現(xiàn)該基因的啟動子序列中不僅存在大量非生物脅迫相關的元件，如低溫相關元件LTR、干旱相關元件MBs等，還存在許多激素相關的元件，如脫落酸相關的元件ABRE和CE3、水楊酸相關元件TCA-ele-ment、生長素相關元件TGA-element、茉莉酸相關元件TGACG-motif，赤霉素相關元件GARE-motif及光響應相關元件ACE、Box I、Box II和G-Box等。其中，脫落酸是一種重要的激素，在植物低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫中發(fā)揮非常關鍵的調(diào)控作用。表明MeTPS6基因可能從轉錄水平參與干旱、低溫和光照（遮蔭）脅迫響應。

2.4MeTPS6基因在不同品種不同組織中的表達特性分析結果

MeTPS6基因在w14、Ku50和Arg7葉片和根中的表達情況如圖4所示。在葉片中，MeTPS6基因在W14的表達量最高，Ku50次之，Arg7最低，均達顯著差異（P<0.05，下同）；在根中，MeTPS6～因在Ku50的表達量顯著高于W14和Arg7，而w14和Arg7的差異不顯著（P>0.05，下同）。對7：Ku50和Arg7，MeTPS6基因在根中的表達量均顯著高于葉片，但對于W14，MeTPS6基因在根和葉片中的表達量無顯著差異，故推測木薯從野生種到栽培種的馴化過程中MeTPS6基因受到了人為選擇，使得MeTPS6基因主要在木薯栽培種的根中起調(diào)控作用。MeTPS6基因在Ku50不同組織中的表達特性如圖5所示。MeTPS6基因的表達量在儲藏根中最高，須根次之，二者均顯著高于莖、葉柄和葉片。

2.5MeTPS6基因在不同脅迫處理下的表達模式分析結果

干旱脅迫下，MeTPS6基因在Ku50不同組織中的表達模式如圖6-A所示。隨干旱脅迫時間的延長，MeTPS6基因的表達量在未展開葉顯著下調(diào)，在脅迫3和24h后表達量分別下降17%和24%；MeTPS6基因的表達量在第一片完全展開葉和老葉中均無顯著變化；MeTPS6基因的表達量在根中顯著上調(diào)，在脅迫3和24垢的表達量分別是對照（脅迫0h）的3.0和2.7倍。

低溫脅迫下，MeTPS6基因在Ku50不同組織中的表達模式如圖6-B所示。MeTPS6基因的表達模式在不同組織中存在明顯差異，隨低溫脅迫時間的延長，在未展開葉中MeTPS6基因的表達量先顯著上升后顯著下降；在第一片完全展開葉中MeTPS6基因的表達量先無顯著變化后顯著下降；在根中MeTPS6基因的表達量先顯著上升后無顯著變化。

遮蔭脅迫下，MeTPS6基因在Ku50不同組織中的表達如圖6-C所示。MeTPS6基因的表達量在未展開葉、第一片完全展開葉和老葉中均顯著上調(diào)，脅迫后MeTPS6基因的表達量分別是對照的1.2、1.5和1.3倍。

綜上所述，干旱、低溫和遮蔭脅迫可顯著誘導MeTPS6基因表達，且在干旱和低溫脅迫下，MeTPS6基因在不同組織中的表達模式存在明顯差異，推測在不同組織中MeTPS6基因抗逆境脅迫的調(diào)控功能不同。

2.6MeTPS6基因共表達調(diào)控網(wǎng)絡分析結果

為初步了解MeTPS6基因參與的基因調(diào)控網(wǎng)絡，利用STRING數(shù)據(jù)庫將MeTPS6基因映射到擬南芥同源序列（AtTPS6）進行共表達分析，結果如圖7所示。在高置信度（Confidence=0.8）的情況下，共找到13個共表達基因，其中有10個為TPS同源基因，表明這些同源基因可能相互協(xié)調(diào)，共同參與植物生物學過程；另外3個基因（CAT、CAT1和F5M15.5）均編碼過氧化氫酶，主要參與保護細胞免受過氧化氫的毒性作用。推測TPS基因與CAT基因在脅迫條件下共同發(fā)揮氧化還原作用，以保護植物細胞免受傷害，從而增強植物的抗逆性。

3討論

TPS是海藻糖生物合成途徑中的關鍵酶，在植物干旱、低溫、高鹽等逆境脅迫下發(fā)揮重要作用。植物中TPS基因以基因家族的形式存在，大部分TPS蛋白含有TPS基因家族保守結構域（Henry et a1.，2014）。目前，已從擬南芥、水稻、香蕉、辣椒等多個物種中克隆獲得TPS基因，并對其功能進行深入研究（Li et a1.，2011；魏兵強等，2016；邢文婷等，2017），但在木薯中尚無相關報道。本研究從木薯葉片克隆獲得MeTPS6基因，其編碼854個氨基酸，含有TPS家族保守結構域，與楊樹和杞柳TPS基因的親緣關系較近。

TPS基因在植物不同組織中的表達量存在明顯差異（丁菲等，2012；魏兵強等，2016），故推測TPS基因在植物不同組織中發(fā)揮不同的調(diào)控功能，如辣椒CaTPS基因在葉片中的表達量是根和莖中的5.0～6.0倍（魏兵強等，2016）；香蕉MaTPS基因在球莖、假莖和葉中表達量較高，在果實中較低（王安邦等，2016）；茶樹CsTPS基因在花中表達量最高，根次之，最低是莖、芽、葉和種子，表達豐度僅為花的13%～41%（丁菲等，2012），因此，TPS；～因表達呈明顯的組織特異性。本研究也發(fā)現(xiàn)，MeTPS6基因在儲藏根中的表達量最高，在莖、葉柄和葉片中的表達量最低，表明MeTPS6基因主要在木薯的儲藏根中發(fā)揮抗脅迫調(diào)控作用。

啟動子是基因表達調(diào)控的重要元件。本研究通過對MeTPS6基因的啟動子序列進行分析，結果發(fā)現(xiàn)啟動子序列存在大量非生物脅迫相關元件、激素相關元件及光響應相關元件，由此推測MeTPS6基因參與低溫、干旱和光照（遮蔭）脅迫下抗脅迫相關的調(diào)控。因此，本研究分別對木薯進行干旱、低溫和遮蔭脅迫，并比較分析木薯不同組織中MeTPS6基因的表達情況，結果表明，MeTPS6基因表達受干旱、低溫和遮蔭脅迫誘導，其原因可能是在干旱、低溫等脅迫條件下，植物體內(nèi)會迅速積累各種小分子化合物（海藻糖、脯氨酸等）以保持細胞的水含量，同時細胞中抵抗氧化損傷的關鍵酶包括超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶會被激活（Fu et a1.，2016），故相關基因表達上調(diào)。本研究還發(fā)現(xiàn)多個TPS同源基因（包括METPS6）和CA瑾因共表達，間接驗證了上述推論。脫落酸是植物響應干旱、低溫等非生物脅迫的一種重要的植物激素（Shinozaki，2007）。雖然本研究在MeTPS6基因的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)脫落酸相關元件（ABRE），但MeTPS6基因是否通過脫落酸途徑參與木薯抗干旱、低溫等非生物脅迫，及CAT基因是否也參與相關基因調(diào)控網(wǎng)絡尚不清楚，均有待深入研究。

4結論

MeTPS6基因主要在木薯的根（特別是儲藏根）中表達，并從轉錄水平參與干旱、低溫和遮蔭脅迫響應，可作為候選基因進一步研究其在木薯抗逆中的功能。

（責任編輯陳燕）