四川稻城傳統干酪中乳酸菌的分離鑒定及功能研究

劉絨梅 田圓圓 耿琦 史健陽 張越 孫群

摘 要：為獲取具優良加工性能和降解膽固醇功能的乳酸菌，從四川稻城兩類傳統干酪（牦牛奶餅、酥油奶餅）中分離篩選得到7株乳酸菌，經16S rRNA序列鑒定有5株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。對其進行耐酸、耐膽鹽、表面疏水性及自聚合能力、抑菌和降膽固醇檢測，結果表明，7株菌均具一定的耐酸和耐膽鹽能力，在pH 3.5和0.1%膽鹽濃度條件下可生長；菌株N-4疏水性達29.57%，N-8自聚能力達66.09%；菌株N-8對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈分別為11.17 mm和15.00 mm，抑菌能力均強于其他菌株；菌株N-1可降解培養基中的膽固醇，降解率達31.77%，有望利用其發酵生產具降膽固醇能力的新型功能性乳制品。綜上，從傳統干酪中分離篩選的乳酸菌具有潛在的益生功能，可應用于功能性乳制品開發。

關鍵詞：傳統干酪；乳酸菌；功能特性；膽固醇

文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2017）12-0058-05

Abstract： In order to obtain lactic acid bacteria（LAB） of excellent processing properties and beneficial functions of lowering cholesterol， seven strains of lactic acid bacteria were isolated from two kinds of traditional cheese from Daocheng， Sichuan， among which five were identified as Lactobacillus plantarum by 16S rRNA sequence. All strains were subjected to acid and bile salt resistance， surface hydrophobicity and self-aggregation， antibacterial and cholesterol-lowering test. The results showed that all the bacterial strains had a certain degree of acid resistance and bile salt tolerance， and they could grow under the conditions of pH 3.5 and 0.1% bile salt. The hydrophobicity of N-4 was 29.57% and the self-aggregation capacity of N-8 was 66.09%； The antibacterial activity of N-8 to Escherichia coli and Staphylococcus aureus was the strongest， with the inhibition zone being 11.17 mm and 15.00 mm， respectively. The strain N-1 can degrade the cholesterol in the medium， and the degradation rate was 31.77%， and it is expected to be applied on the development of new functional dairy products with the ability of lowering cholesterol. In conclusion， LAB strains isolated from traditional cheese has a potential probiotic function.

Keywords： traditional cheese； lactic acid bacteria； function properties； cholesterol

0 引 言

傳統發酵乳制品具有悠久的歷史，其蘊含著豐富的微生物資源，成為近年來研究的熱點。稻城縣地處中國四川省西南邊緣，屬于青藏高原東南部屬康巴藏區的甘孜藏族自治州，傳統發酵而成的奶制品是當地的重要食品。這些傳統奶制品是通過本土菌株發酵而成，經過長期馴化，具有優良性狀的菌株得以保留。大量研究表明，傳統乳制品中的優勢菌株為乳酸菌[1-2]。從傳統乳制品中分離篩選得到的乳酸菌具有多種益生功能，并對人體有多種功效，得到了廣泛的應用[3]。目前研究最多的是新疆、內蒙古一帶的傳統發酵乳，內蒙古農業大學經過10年的研究，在2007年建立起了中國第一個具有自主知識產權的乳酸菌菌種資源庫[4]，而西南地區傳統發酵乳中乳酸菌的相關研究相對較少。此外，乳制品中乳酸菌生物多樣性隨不同地區和制作方式而不同。因此，從不同地區不同種類的傳統發酵乳制品中分離、篩選具優良性能和功能的乳酸菌菌種，對新型和功能性乳品及其他發酵行業的發展具有重要意義。

本研究從四川稻城地區2類常見的傳統乳制品（奶餅、酥油奶餅）中分離篩選到15株乳酸菌，對初篩后的7株乳酸菌進行耐酸、耐膽鹽、表面疏水性及自聚合能力、抑菌和降膽固醇試驗的研究，最終得到1株可在體外將膽固醇降解31.77%的植物乳桿菌N-1，其余菌株也表現出一定的優勢特點，豐富了西南地區功能乳酸菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣 品

兩份干酪樣品（奶餅、酥油奶餅）采自四川省稻城縣木拉鄉卡龍村，是當地牧民發酵的牦牛乳制品。

1.1.2 菌 種

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），系本實驗室保藏菌種。

1.1.3 試 劑

鄰苯二甲醛（98%），牛膽鹽（上海源葉生物科技公司）；膽固醇（上海惠世生化試劑有限公司）。

MRS液體培養基：葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉6.0 g，吐溫80 1.0 mL，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，純水1 L，pH自然（加1.5%～2.0%瓊脂為固體培養基）。

MRS-膽固醇培養基：MRS液體培養基中添加不同濃度的牛膽鹽，并加入膽固醇使培養基中膽固醇終濃度為100 μg/mL。

LB培養基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出物5.0 g，氯化鈉10.0 g，純水1 L，pH自然（加1.5%～2.0%瓊脂為固體培養基）。

PBS緩沖液：磷酸二氫鉀0.2 g， 磷酸氫二鈉1.15 g，氯化鈉8 g，氯化鉀0.2 g，加入800 mL 純水攪拌溶解，濃鹽酸調至相應pH值，定容至1 L。

1.2 儀器與設備

AFZ-100Z-U 超純水儀（美國艾科浦公司）；PS-25精密pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；BX53F光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；UV-2600紫外分光光度計（日本SHIMADZU公司）；TGL-16G臺式冷凍高速離心機（上海醫用分析儀器廠）；TS-1小型搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.3 方 法

1.3.1 菌株的分離、純化及初篩

兩份樣品各稱取10 g，于裝有90 mL無菌水的錐形瓶中充分攪拌，置于搖床振蕩60 min，使樣品完全分散。吸取懸液，10倍梯度稀釋分別涂布于MRS固體培養基上，37 ℃培養48 h，肉眼觀察挑取不同形態和大小的單菌落，平板劃線純化3次。革蘭氏染色，觸媒試驗初步確定為疑似乳酸菌，將純化好的菌株保存于50%甘油中，-40 ℃冷凍保存備用。

將分離純化得到的菌株以10%的接種量分別在pH 3.5和含0.1%牛膽鹽的MRS液體培養基中培養20 h，分別測定0 h和20 h的OD600。對在這兩個條件下均可生長的菌株進一步研究。

1.3.2 菌株鑒定

采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，細菌通用引物27F/1492R擴增16S rRNA，將測得的16S rRNA序列進行NCBI BLAST比對。

1.3.3 菌株耐酸和耐膽鹽試驗

耐酸試驗：將活化三代的乳酸菌以1%的接種量分別接種至pH為3.5、2.5、2.0的PBS緩沖液中，37 ℃靜置培養3 h，梯度稀釋平板法測定乳酸菌活菌數。

耐膽鹽試驗：將活化三代的乳酸菌以1%的接種量分別接種至含0.1%、0.2%、0.3%的牛膽鹽的MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養5 h，梯度稀釋平板法測定乳酸菌活菌數。

1.3.4 疏水性和自聚力試驗

疏水性試驗參考Sadishkumar[5]的方法稍加修改。乳酸菌于37 ℃，120 r/min搖床培養24 h， 4 ℃，5 000 g離心5 min，棄上清，收集菌體沉淀。pH值為7.4的無菌PBS緩沖液洗滌菌體沉淀2次，重懸于無菌的PBS緩沖液中，調整菌懸液的吸光值（OD600 nm）為0.8±0.05（A0）。取2 mL菌懸液與2 mL二甲苯充分振蕩混勻，室溫靜置30 min。小心吸取水相，于600 nm下測定吸光值（A1）。

表面疏水性=（1-A1/A0）×100%

自聚力試驗參考Todorov等[6]的方法稍加修改。菌懸液制備同疏水性試驗，取4 mL菌懸液，室溫靜置24 h。小心吸取上層1 mL，于600 nm下測定吸光值（A24）。

自聚力=（1-A24/A0）×100%

1.3.5 抑菌試驗

以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，乳酸菌發酵液4 ℃，10 000 g離心 10 min，其上清液經0.22 μm濾膜過濾除菌進行抑菌試驗。將濃度為105 CFU/mL的指示菌培養液100 μL分別涂布于LB固體平板上，用鑷子夾取已滅菌的牛津杯放到 LB 固體培養基上，牛津杯中滴加200 μL除菌的乳酸菌上清液。37 ℃培養 16 h后，測量抑菌圈的直徑。

1.3.6 體外降膽固醇能力

體外降解膽固醇試驗參照Shehata等[7]的方法并加以修改。將活化三代的乳酸菌按1%的接種量接種至MRS-膽固醇培養基，37 ℃ 120 r/min搖床培養24 h。4 ℃下10 000 g離心 10 min，取1 mL上清液于具塞比色管，加入1 mL 33%的KOH和2 mL無水乙醇，渦旋振蕩90 s，37 ℃水浴15 min，冷卻至室溫，加入2 mL無菌水和3 mL正己烷，渦旋振蕩60 s，靜置10 min，取上層液體1 mL于新的試管65 ℃水浴蒸干，加入2 mL鄰苯二甲醛-冰乙酸溶液（0.5 mg/mL），混勻，室溫避光反應 10 min，加入1 mL 濃硫酸終止反應，靜置 10 min，測其在 550 nm處吸光值。

降解率=（1-A1/A0）×100%

式中：A1——接種乳酸菌的培養液經上述處理后的OD值；

A0——未接種乳酸菌的培養液經上述處理后的OD值。

所有試驗均重復3次，每次設3個平行，取平均值。

2 結果與分析

2.1 分離初篩的乳酸菌及鑒定

初步分離到20株疑似乳酸菌的菌落，革蘭氏染色、觸媒試驗確定5株非乳酸菌。對其余15株進行耐酸及耐膽鹽初篩，只有7株能在pH 3.5和0.1%膽鹽濃度條件下生長，對其進行16S rRNA鑒定，結果如表1所示。7株菌中有5株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），分別是N-1，N-4，N-5， N-8，S-3，而N-2和S-7被鑒定為Lactobacillus sp.。

2.2 耐酸和耐膽鹽能力

乳酸菌耐酸試驗結果如表2所示。隨著pH值的下降，7株乳酸菌的活菌數明顯減少。當pH值為2.5時，活菌數下降3～4個數量級，當pH值為3.5時，除S-3和S-7外，其余5株菌的存活率達95%以上，表明篩選到的乳酸菌對酸有一定的耐受性。

乳酸菌耐膽鹽試驗結果如表3所示。隨膽鹽濃度升高，7株乳酸菌的活菌數呈遞減趨勢。當膽鹽濃度為0.1%時，存活率均在95%以上，當膽鹽濃度為0.2%時，乳酸菌的活菌數還能保持在106 CFU/mL。表明篩選到的乳酸菌對膽鹽有一定的耐受性。

2.3 疏水性和自聚合能力

細菌表面疏水性和自聚合能力常作為益生菌對腸道黏附特性的初篩指標[8]。乳酸菌疏水性和自聚力試驗結果如表4所示。7株乳酸菌的疏水性和自聚力相差不大，其中菌株N-4的疏水性較高，達29.57%，而菌株N-8的自聚能力最強，達66.09%。

2.4 抑菌試驗

乳酸菌發酵上清液對常見致病菌和條件致病菌的抑菌效果如表5所示。7株乳酸菌發酵上清液抑制金黃色葡萄球菌的能力強于大腸桿菌，其中菌株N-8對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力最強，抑菌圈直徑分別為11.17 mm和15.00 mm。

2.5 乳酸菌體外降膽固醇能力

7株乳酸菌體外降解膽固醇試驗結果如圖1所示。菌株N-1降解膽固醇的能力最強，達31.77%，S-7次之，為27.64%。

3 討 論

本研究從兩類干酪樣品中分離初篩選到7株乳酸菌，通過16S rRNA基因序列分析，其中有5株為植物乳桿菌（L. plantarum），占分離菌株的絕大部分。這與Sun等[9]從青海海南州、海西州和海北州等地區采集的自然發酵牦牛乳中植物乳桿菌（L. plantarum） 和乳酸乳球菌乳酸亞種（Lc. lactis subsp.lactis）為優勢菌群的研究相符；與之不同的是，張和平[10]研究表明四川地區自然發酵乳優勢菌為嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）和瑞士乳桿菌（L. helveticus），而Bao等[11]研究表明四川紅原草原20份酸牦牛乳中嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）是優勢菌群。這表明不同地區和不同制作方式的傳統發酵乳中乳酸菌生物多樣性不同，優勢菌群也不同。趙建[12]的研究表明植物乳桿菌SP-3不僅能夠加快干酪體系中蛋白質的水解進程，促進干酪成熟，還能提高產品的風味強度和風味接受度。

乳酸菌作為一種益生菌，只有具有良好的耐酸和耐膽鹽能力才能發揮益生作用。非空腹狀態下人體胃液的pH值在2.5～3.5的范圍內波動，小腸中膽鹽的質量濃度在0.03%～0.3%范圍內波動[13]。7株乳酸菌在pH 3.5和0.1%膽鹽濃度的條件下存活率達90%以上，可在胃腸道存活，具有一定的益生潛力。菌株N-4的疏水性最高，而菌株N-8的自聚力最高，均高于Das等[14]文獻所報道，表明這兩株菌對腸道的黏附性可能較強。

研究表明，乳酸菌對致病菌有一定抑制作用，其代謝物得到廣泛應用[15-16]。菌株N-8發酵上清液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有較強的抑菌能力，具有潛在的應用價值。

隨著生活水平的提高和飲食結構的改變，過多膽固醇的攝入會導致高血脂癥，進而會引發冠心病等心腦血管疾病，嚴重威脅人類健康[17]。已有研究表明乳酸菌對膽固醇的降低有積極作用[18]。而篩選得到的菌株N-1可在體外將膽固醇降解31.77%，與之相似的是劉曉強[19]從傳統酸肉中篩選得到一株高效降膽固醇的消化乳桿菌CT24，其降低率達31.23%。因此，該菌株有望添加到功能性食品中進一步研究、開發和應用。

4 結束語

本研究篩選得到的7株乳酸菌來自四川稻城傳統乳制品，有利于西南地區乳酸菌資源的收集。通過功能篩選，獲得了2株具有潛在價值的乳酸菌，即一株有較強抑菌能力，另一種有較強降膽固醇能力，可為乳酸菌在功能性食品中的應用提供參考。

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（編輯：莫婕）