廣西家蠶核型多角體病毒株gp64基因克隆與序列分析

陳朝蓉　屈達才　朱方容　李俊　閉立輝　梁湘

摘要：【目的】了解廣西家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）毒株gp64基因的保守性，并掌握其具體的突變位點，為研究核型多角體病毒（NPV）種內的微進化模式提供參考依據。【方法】對廣西不同桑蠶產區的19株BmNPV毒株進行gp64基因克隆與測序，分析完整開放閱讀框（ORF）序列的同源性和單核苷酸多態性，并構建基于gp64基因的遺傳進化樹。【結果】廣西BmNPV毒株的gp64基因ORF序列不一致，存在1590、1593和1599 nt三種類型，是由于第94～96位缺失GCG或第97～102位插入GCGCCG所致，且插入核苷酸突變僅在廣西BmNPV毒株中出現。僅GXSL毒株與T3毒株的核苷酸及其推導氨基酸序列同源性均達100.0%，其余18株毒株與T3毒株的核苷酸序列同源性在98.5%～99.2%，其推導氨基酸序列同源性在98.7%～99.6%。19株廣西BmNPV毒株被分為兩個亞群（clade Ⅰ和clade Ⅱ），其中11株獨立形成clade Ⅱ，7株獨立形成clade Ⅰ中的一個亞群；廣西毒株在多個位點出現同義核苷酸突變，呈一定的規律性。【結論】廣西BmNPV毒株的gp64基因具有遺傳多樣性，在遺傳進化上較獨立，插入突變顯示出地域特點。

關鍵詞： 家蠶核型多角體病毒（BmNPV）；gp64基因；克隆；序列分析；微進化；廣西

中圖分類號： S884.51 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）02-0328-08

Abstract：【Objective】This research aimed to understand gp64 gene conservation of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV） Guangxi isolates and master the specific site of mutation， which could provide reference for study of intraspecific microevolution pattern of nucleopolyhedrovirus（NPV）. 【Method】The gp64 genes of 19 BmNPV strains collected from different sericultural areas in Guangxi were cloned and sequenced. Homology and the mononucleotide polymorphisms of gp64 complete open reading frame（ORF） were analyzed， and phylogenetic tree of gp64 gene was established. 【Result】The gp64 gene ORF sequences of Guangxi BmNPV strains were not consistent， showing three types as 1590 nt， 1593 nt and 1599 nt. The diversities were caused by GCG deletion in position 94-96， and GCGCCG insertion in position 97-102. insertion mutations of nucleotide only happened in Guangxi BmNPV strains. Only GXSL strain shared 100.0% homologies in nucleotide and deduced amino acid sequence with T3 strain. The other 18 strains shared 98.5%-99.2% homology in nucleotide sequence and 98.7%-99.6% homology in deduced amino acid sequence with T3 strain. All 19 Guangxi BmNPV strains were separated into two clades（clade Ⅰand clade Ⅱ）. Among them， 11 strains were included in clade Ⅱ separately and 7 strains were included in a sub-clade of clade Ⅰ. Synonymous substitutions occurred in several positions of gp64 genes from Guangxi BmNPV strains， showing certain regularity. 【Conclusion】The gp64 genes of Guangxi BmNPV strains embodies genetic diversity and independent genetic evolution. The insertion mutation indicates territorial characteristic.

Key words： Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV）； gp64 gene； clone； sequence analysis； microevolution； Guangxi

0 引言

【研究意義】家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）是桿狀病毒科鱗翅目特異核型多角體病毒屬（α-NPV）成員之一，其病毒粒子呈桿狀，外包被有囊膜（King et al.，2011）。BmNPV基因組為大型環狀超螺旋的雙鏈DNA分子，最早測序的日本T3毒株基因組超過128 kb，包含136個預測編碼蛋白大于60個氨基酸的開放閱讀框（ORF）；其中第105個ORF為gp64基因，起止位點為99864～101436，編碼530個氨基酸，與苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa californica multinucleocapsid nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）具有95%的相似性（Gomi et al.，1999）。BmNPV的gp64基因在病毒感染早期和晚期均能轉錄表達，感染早期轉錄起始于一個共有的CAGT基序，感染晚期轉錄則由3個保守的TAAG基序引發，家蠶卵巢細胞感染后6 h即可檢測到少量的BmNPV 囊膜糖蛋白（GP64），大量表達始于感染后12 h，并在隨后的感染過程一直持續表達；AcMNPV GP64蛋白于感染后6～36 h在Sf21細胞中大量表達，但從感染后48 h起表達量驟減（Masmudur Rahman and Gopinathan，2003）。BmNPV是家蠶血液型膿病的病原，該病毒傳染性強、致死率高，且目前尚無有效的治療方法，給蠶繭生產帶來巨大經濟損失。gp64基因是BmNPV重要的結構蛋白基因，深入了解其遺傳多樣性，對開展BmNPV的致病性、進化模式研究及家蠶血液型膿病防控均具有重要意義。【前人研究進展】核型多角體病毒（NPV）在復制過程中產生兩種類型的病毒粒子，即出芽型病毒（BV）和包埋型病毒（ODV）。二者的基因型相同，但表型不同，因此在組織感染特異性和入侵宿主細胞途徑等方面存在差異。其中，ODV造成宿主中腸柱狀上皮細胞原發性感染，對病毒在宿主個體間的傳播起主要作用；BV則造成體內其他細胞的繼發性感染，主要負責病毒在宿主細胞間的傳播。這些差異可能與病毒囊膜的形態結構和化學成分不同有關（Masmudur Rahman and Gopinathan，2003；Slack and Lawrence，2005；Sparks et al.，2011）。NPV gp64基因編碼BV所特有的GP64蛋白。GP64蛋白結構可分為信號肽區、胞外區、跨膜區和胞內區，經加工修飾的成熟蛋白在信號肽引導下錨定于細胞膜表面，病毒核衣殼通過細胞膜出芽獲得該蛋白，形成表面的嵌突結構。GP64蛋白在病毒入侵方面發揮著重要作用，不僅參與對宿主細胞受體的識別和吸附（Hefferon et al.，1999；Zhou and Blissard，2008），還介導病毒囊膜與內吞體膜融合而釋放病毒核衣殼（Blissard and Wenz，1992；Monsma and Blissard，1995）。GP64蛋白還與病毒的宿主域有關（Katou et al.，2006；Xu et al.，2012），如BmNPV GP64蛋白的糖基化修飾被抑制后，其蛋白膜融合活性降低，具有傳染性的BV產量減少（Masmudur Rahman and Gopinathan，2003）。此外，有研究表明體外合成與gp64基因相對應的dsRNA能抑制BmNPV在BmN細胞中的表達和增殖（夏定國等，2007）。【本研究切入點】目前，有關BmNPV流行毒株gp64基因的序列信息不多，對該基因的保守性和變異程度了解較少。不同BmNPV毒株的gp64基因ORF存在明顯差異，王運湘等（2000）所測毒株的gp64基因ORF為1530 nt，編碼509個氨基酸；印度毒株BmNPV-BGL為1539 nt，編碼512個氨基酸（Masmudur Rahman and Gopinathan，2003）；T3、Zhejiang、India和Guangxi毒株為1593 nt，編碼530個氨基酸；Cubic毒株為1590 nt，編碼529個氨基酸（Xu et al.，2013）。這種差異是否對蛋白的功能產生影響，是否與病毒的致病性有關，是否普遍存在于不同BmNPV毒株中，均有待進一步探究證實。【擬解決的關鍵問題】對廣西不同桑蠶產區來源的19株BmNPV毒株進行gp64基因克隆和測序，分析其序列的同源性和單核苷酸多態性，構建遺傳進化樹，旨在了解廣西BmNPV毒株gp64基因的保守性，并掌握其具體的突變位點，為研究NPV種內的微進化模式提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

19株BmNPV毒株從廣西不同桑蠶產區采集，保存于廣西大學農學院，采集地點及其gp64基因GenBank登錄號分別為：GXSL（上林，KX359332）、GXHX（橫縣，KX359320）、GXDA（都安，KX359316）、GXLJ（柳江，KX359323）、GXLiuC（柳城，KX359322）、GXRS（融水，KX359330）、GXNM（寧明，KX359325）、GXBB（八步，KX359315）、GXRX（容縣，KX359331）、GXLingY（凌云，KX359321）、GXNP（那坡，KX359326）、GXTL（田林，KX359333）、GXLS（靈山，KX359324）、GXPB（浦北，KX359327）、GXHS（合山，KX359319）、GXGN（港南，KX359318）、GXGB（港北，KX359317）、GXPN（平南，KX359328）和GXQT（覃塘，KX359329）。Ex Taq DNA聚合酶、限制性內切核酸酶EcoRⅠ和PstⅠ、pMD18-T載體購自TaKaRa公司，DNA純化回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1. 2 BmNPV基因組DNA抽提

將病死蠶置于滅菌研缽中研磨，加入適量無菌超純水稀釋，用3層紗布過濾除去雜質，濾液反復以400和4000 r/min差速離心10 min，提純病毒多角體。取多角體懸液加入等量的多角體裂解緩沖液（0.2 mol/L Na2CO3+0.32 mol/L NaCl），混勻，室溫靜置30 min，12000 r/min離心1 min除去雜質和未裂解的多角體，上清液以1 mol/L Tris-HCl調pH至7.0。采用SDS和蛋白酶K法抽提DNA，具體操作參照《分子克隆實驗指南》。

1. 3 引物設計與合成

根據GenBank中BmNPV T3毒株gp64基因的序列信息，用Oligo 6.0和Primer 5.0設計針對gp64基因的特異性引物（F：5'-GCCAAATAGCGGTCGGGTAT-3'和R：5'-CGCTTGTGGTATGAGAAACGAAC-3'）。引物由廣州華大基因科技股份有限公司合成。

1. 4 目的基因克隆測序

PCR反應體系50.0 μL：10×Ex Taq Buffer 5.0 μL，dNTP混合液（各2.5 μmol/L）5.0 μL，上、下游引物（50 pmol/μL）各2.0 μL，Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，DNA模板2.0 μL，超純水補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行35個循環；72 ℃延伸10 min。反應結束后用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，膠回收目的片段，與pMD18-T載體連接，轉化感受態細胞DH5α，經藍白斑篩選，挑取陽性克隆于LB培養基過夜培養，抽提質粒并進行EcoRⅠ/PstⅠ雙酶切鑒定。陽性質粒送至廣州華大基因科技股份有限公司測序，選擇雙向測序，測序結果利用MegAlign和EditSeq程序進行剪切與拼接。

1. 5 序列比對分析

選取NCBI上已發表BmNPV及其他NPV的gp64基因完整ORF序列為參考，以BmNPV T3株為標準參考。BmNPV參考毒株分別為：T3（日本，L33180），N9（日本，AB253773），Brazilian（巴西，KJ186100），C1、C2、C6（韓國，KF306215、KF306216、KF306217），Zhejiang（浙江，JQ991008），Cubic（蘇州，JQ991009），India（印度，JQ991010），Guangxi（廣西，JQ991011）；其他NPV參考毒株分別為：AcMNPV（L22858），RoMNPV（薄荷灰夜蛾核型多角體病毒，AY145471），Boma S1、S2（野桑蠶核型多角體病毒，FJ882854、JQ071499）。以MegAlign程序的ClustalX對參考毒株與廣西BmNPV毒株的gp64基因ORF序列進行比對，分別比較核苷酸及其推導氨基酸的同源性，通過MEGA 5.0的Kimura 2-parameter模式構建遺傳進化樹，分析gp64基因的單核苷酸多態性。

2 結果與分析

2. 1 PCR擴增和酶切鑒定結果

BmNPV T3株gp64基因的ORF為1593 nt，預期擴增廣西毒株的目的片段約1700 bp，包含完整的ORF。PCR擴增和酶切鑒定的目的片段大小與預期結果相符（圖1）。

2. 2 gp64基因ORF序列測定結果

測序發現，廣西BmNPV毒株的gp64基因ORF序列存在差異，有1590、1593和1599 nt三種類型，分別編碼529、530和532個氨基酸。其中，GXSL、GXBB、GXDA、GXLS和GXLJ 5株毒株的gp64基因ORF為1593 nt，與標準參考T3毒株的gp64基因ORF相同；GXLingY、GXLiuC、GXNM、GXRS、GXRX、GXNP和GXTL 7株毒株的ORF缺失第94～96位核苷酸（GCG），造成一個丙氨酸的缺失突變；GXGB、GXGN、GXHX、GXHS、GXPB、GXPN和GXQT 7株毒株的ORF在第97～102位6個核苷酸（GCGCCG）插入，造成一個丙氨酸和一個脯氨酸的插入突變；除N9株外，其他BmNPV毒株均比AcMNPV多出序列前端的54個核苷酸，即蛋白N端的18個氨基酸殘基（圖2）。

2. 3 gp64基因ORF序列比對結果

以T3毒株為標準參考，比對19株廣西BmNPV毒株gp64基因ORF的同源性。結果（表1）顯示，只有GXSL毒株與T3毒株的核苷酸及其推導氨基酸序列同源性均達100.0%，其余18株毒株與T3毒株的核苷酸序列同源性在98.5%～99.2%，其推導氨基酸序列同源性在98.7%～99.6%，說明廣西BmNPV毒株與T3毒株的gp64基因具有較高的同源性。此外，僅GXGB與GXGN、GXLingY與GXNP的gp64基因ORF核苷酸序列完全相同，同源性為100.0%，說明該基因在BmNPV種群內極易發生變異。以AcMNPV、RoMNPV和Boma S2的gp64基因序列為不同種NPV參考，發現廣西BmNPV毒株與其核苷酸序列的同源性小于或等于97.0%。Boma S1的gp64基因與所有廣西BmNPV毒株的核苷酸序列同源性均大于99.0%，說明廣西BmNPV毒株與BmNPV存在較高的同源性。

2. 4 遺傳進化樹分析結果

為了解廣西BmNPV毒株與其他參考毒株的遺傳進化關系，根據gp64基因ORF序列構建遺傳進化樹。結果顯示，遺傳進化樹可分為兩大群（圖3），所有BmNPV毒株歸屬于同一群，除Boma S1外的其他NPV歸于另一群，說明不同種的NPV在進化上存在一定差異，BmNPV的群外參照成立，分群合理。Cubic是一個能形成四方形多角體的BmNPV毒株，除此之外，其余BmNPV毒株被分為3個亞群（clade Ⅰ、clade Ⅱ和clade Ⅲ）。19株廣西BmNPV毒株被分為2個亞群（clade Ⅰ和clade Ⅱ）。其中，有11株廣西BmNPV毒株位于clade Ⅱ，分別為GXGB、GXGN、GXLS、GXPN、GXRS、GSHS、GXQT、GXPB、GXHX、GXLingY和GXNP，形成一個獨立的群；另外8株與參考毒株T3、Zhejiang、Guangxi同屬于clade Ⅰ，除GXSL外的7株獨立形成clade Ⅰ中的一個亞群。clade Ⅲ則由6個BmNPV參考毒株和Boma S1毒株構成。GXGB和GXGN、GXLingY和GXNP分別位于獨立的亞群。

2. 5 單核苷酸多態性分析結果

對BmNPV gp64基因ORF進行單核苷酸多態性（SNPs）分析，結果顯示，除GXSL毒株與T3毒株的序列完全相同外，其余的廣西BmNPV毒株和參考毒株均發生369C、768G、861C、891G和1518T突變，這些突變均為同義突變，核苷酸的替換不引起氨基酸改變；而且這些廣西BmNPV毒株和部分參考毒株還發生1395C同義突變和1580C非同義突變，其中1580C突變使得絲氨酸→蘇氨酸。除GXSL和GXLS毒株外，所有廣西BmNPV毒株均發生839A非同義突變，相應位點的氨基酸由精氨酸→賴氨酸；除GXSL、GXLS、GXRS和GXHX毒株外的廣西BmNPV毒株均發生888A同義突變。部分廣西BmNPV毒株還發生129A、322A、418G、459T、627A、930G、942T、1290T和1540A突變，其中322A、418G和1540A為非同義突變，而在所有參考毒株中均未出現這3個位點的非同義突變。在24個核苷酸突變位點中，只有5個為非同義突變，氨基酸發生了改變，其余均為同義突變（表2）。廣西BmNPV毒株中有部分毒株在第94～96位缺失核苷酸（GCG），部分毒株則在第97～102位插入核苷酸（GCGCCG）（圖2）。廣西BmNPV毒株在多個位點出現相同的核苷酸突變，呈一定的規律性。

3 討論

廣西BmNPV毒株gp64基因ORF序列存在1590、1593和1599 nt三種類型，是由于第94～96位缺失GCG或第97～102位插入GCGCCG所致，具有遺傳多樣性。插入核苷酸（GCGCCG）突變僅在廣西BmNPV毒株中出現，顯示出一定的地域特點。廣西BmNPV毒株gp64基因ORF序列突變造成一個丙氨酸缺失或一個丙氨酸和一個脯氨酸插入，兩種突變皆位于氨基酸序列的近N端。AcMNPV gp64基因編碼512個氨基酸，N端的前20個氨基酸殘基構成疏水的膜定位信號肽區（Oomens and Blissard，1999）。通過比對AcMNPV與BmNPV GP64蛋白的氨基酸序列，發現前者缺失N端的18個氨基酸殘基，廣西BmNPV毒株gp64基因近N端的突變正好位于相應的信號肽區內，而突變的氨基酸皆為疏水性氨基酸，其缺失或插入是否對信號肽區的性質和功能產生影響尚有待進一步探究。

19株廣西BmNPV毒株的gp64基因ORF序列中，僅GXSL毒株與標準參考T3毒株的核苷酸序列同源性達100.0%，其余毒株在98.5%～99.2%。這些毒株的多角體蛋白基因polh與T3毒株的相比，其同源性均超過99.5%（Liang et al.， 2013），說明gp64基因的保守性不如polh基因。GXGB與GXGN、GXLingY與GXNP比較，gp64基因ORF核苷酸序列同源性均為100.0%，且遺傳進化樹結果顯示分別位于獨立的亞群；但其polh基因核苷酸序列同源性同為99.9%，p10基因同源性同為100.0%（Liang et al.，2013）。此外，GXGB與GXGN、GXLingY與GXNP毒株的來源地彼此靠近，故推測可能為同一毒株。BmNPV的多角體可在環境中長期保持感染性，通過貿易、交通等人為因素及風雨等自然因素的作用，進行遠距離擴散傳播（Fuxa，2004）。廣西BmNPV毒株與種外參考毒株Boma S1比較，其gp64基因同源性大于99.0%。Xu等（2010）通過對比Boma S1與BmNPV T3的gp64基因，發現其氨基酸序列同源性為99.8%，但Boma S1對家蠶的感染性較低。

本研究構建的遺傳進化樹顯示，所有BmNPV毒株歸于一群，除Boma S1外的其他NPV毒株歸于另一群。雖然BmNPV與AcMNPV、RoMNPV、Boma S2的gp64基因核苷酸同源性較高（高于93.0%），但在遺傳進化上仍存在一定距離。除Cubic毒株外，其余BmNPV毒株被分為3個亞群，其中11個廣西BmNPV毒株獨立形成clade Ⅱ，其中包括7株在第97～102位插入6個核苷酸的毒株。在clade Ⅰ中除GXSL毒株外，其余7個廣西BmNPV毒株獨立形成一個亞群，提示廣西BmNPV毒株在遺傳進化上呈一定的獨特性。基于NPV核心基因構建的系統發育進化樹可知，其分類與宿主的分類一致，提示NPV與宿主間存在共同進化的關系（Herniou et al.，2004）。由于宿主家蠶為經濟昆蟲，人工飼養過程中采取的防病措施及抗病品種的使用，導致BmNPV面臨的選擇壓力比自然界其他NPV種群大，因此其進化速度有可能更快。

廣西BmNPV毒株gp64基因在多個位點出現核苷酸突變，除GXSL外的廣西BmNPV毒株和參考毒株均發生369C、768G、861C、891G和1518T突變。此外，廣西BmNPV毒株均發生1395C同義突變和1580C非同義突變；部分廣西BmNPV毒株還發生129A、322A、418G、459T、627A、930G、942T、

1290T和1540A突變。在24個核苷酸突變位點中，只有5個為非同義突變，其余均為同義替換，即編碼氨基酸簡并密碼的最后一位發生改變。同種NPV不同毒株間的基因型和表型差異，表明NPV存在微進化（Herniou and Jehle，2007），保持遺傳多樣性以應對自然選擇和適應不同的環境條件，但目前對NPV種群微進化的了解有限。BmNPV種群基因組中編碼氨基酸的密碼子多樣化，也可能是微進化的一種方式，以便于更好地利用宿主代謝系統進行繁衍，并有可能逃避宿主免疫系統的識別。

4 結論

廣西BmNPV毒株的gp64基因具有遺傳多樣性，插入突變顯示出地域特點，在遺傳進化上較獨立。該結論可為BmNPV gp64基因結構和功能的探索打下基礎，同時為NPV種內的微進化模式研究提供參考依據。

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（責任編輯 蘭宗寶）