褐牙鲆早期發育階段CRH基因表達及受甲狀腺激素的影響

沈嬌嬌　呂為群

摘要：【目的】探析褐牙鲆仔魚早期發育階段促腎上腺皮質激素釋放激素基因（CRH）的表達情況及受甲狀腺激素的影響作用，為開展牙鲆的人工繁育提供科學依據。【方法】通過實時熒光定量PCR檢測褐牙鲆早期發育階段CRH基因表達量，以ELISA測定褐牙鲆仔魚甲狀腺激素（T3和T4）水平，并測定經外源T3浸泡處理后早期發育褐牙鲆仔魚CRH基因表達量的變化情況，探究CRH和甲狀腺激素在褐牙鲆早期發育階段的影響及作用關系。【結果】1～8日齡褐牙鲆仔魚CRH基因相對表達量呈先升高后降低的變化趨勢，在5日齡達最高值，顯著高于其他日齡的仔魚（P<0.05，下同）。10～42日齡褐牙鲆仔魚CRH基因主要在其頭部表達，尾部CRH基因的相對表達量隨著生長發育的進程而逐漸增加。褐牙鲆仔魚變態前期甲狀腺激素T4含量逐漸增加，變態高峰期迅速升高，在變態后期呈下降趨勢。較其他早期發育時期，甲狀腺激素T3在褐牙鲆變態期維持高水平，但含量低于甲狀腺激素T4。22日齡褐牙鲆仔魚經50 nmol/L外源T3處理2 h后，其頭部和尾部CRH基因的相對表達量顯著升高；但以外源T3處理8 h后，無論是頭部還是尾部，CRH基因的相對表達量均呈顯著下降趨勢。【結論】褐牙鲆早期變態發育需CRH基因高表達及甲狀腺激素積累，二者對褐牙鲆早期變態發育階段具有重要作用并呈互相代償效應。

關鍵詞： 褐牙鲆；促腎上腺激素釋放激素基因（CRH）；甲狀腺激素；變態發育

中圖分類號： S965.399 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）02-0323-05

Abstract：【Objective】The present study investigated expression of corticotropin releasing hormone（CRH） gene and influence of thyroid hormone on it， in order to provide reference for artificial breeding of Paralichthys olivaceus. 【Method】CRH gene expression of P. olivaceus at early development was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Thyroid hormone（T3 and T4） level of P. olivaceus larvae and CRH gene expression after exogenous T3 immersion treatment were measured by ELISA method. The interaction between CRH and thyroid hormone at early development stage of P. olivaceus was studied. 【Result】During 1-8 dph， CRH gene expression went through up-down variation， and reached the peak at 5 dph， which was significantly higher than the value at other day ages（P<0.05， the same below）. At 10-42 dph， CHR gene expression was mainly in head， and expression in tail increased with growth of P. olivaceus. T4 content gradually increased before metamorphosis， and soared at metamorphosis climax， then decreased at metamorphosis postclimax. Compared with other early development stages， T3 maintained at a high level during metamorphosis， but the content was lower than T4. After P. olivaceus at 22 dph treated with 50 nmol/L exogenous T3 for 2 hours， the expression of CRH in head and tail significantly increased； but aftet 8 hours， the expression in head and tail significantly decreased. 【Conclusion】At early metamorphosis stage， P. olivaceus needs to increase CRH expression and accumulate thyroid hormone. Both of them play important roles at early development stage of P. olivaceus and have compensatory effect between each other.

Key words： Paralichthys olivaceus； corticotropin releasing hormone（CRH）； thyroid hormone； metamorphosis

0 引言

【研究意義】褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）是一種重要經濟魚類，廣泛分布在我國、日本和朝鮮等國家。變態前的褐牙鲆仔魚形態與其他硬骨魚類極其相似（Russell，1976），但其幼魚和成魚在形態結構和生活習性上存在極大差別，從仔魚向稚魚生長發育過程中須經歷一個劇烈的變態過程，決定著幼魚和成魚的生長發育狀況。在魚類中，尾部神經內分泌系統（Caudal neurosecretory system，CNSS）多肽可能從尾垂腺直接分泌進入尾靜脈和腎靜脈系統，以確保其快速傳送到靶器官（腎臟、腸、性腺和肝臟）。CNSS是提供促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）的主要場所（Lu et al.，2004，2006），且有大量研究表明魚類CNSS的組織結構與下丘腦—垂體系統有一定的相似性，其分泌物進入血液與靶組織結合，在魚類新陳代謝、滲透壓調節、應激等生理活動中發揮重要作用（McCrohan et al.，2007）。絕大多數魚類的甲狀腺不是一個單獨的腺體，其在形式和位置上也多變，如多數魚類的甲狀腺組織為彌漫性濾泡（Eales and Barrington，1979）。魚類甲狀腺的內穩態受下丘腦—垂體—甲狀腺軸（HPT）的內分泌系統調控，如下丘腦分泌的促甲狀腺激素釋放激素（TRH）和CRH能促進垂體釋放促甲狀腺激素（TSH），TSH刺激甲狀腺濾泡分泌甲狀腺激素（THs），而甲狀腺激素對脊椎動物正常生理功能的維持起重要作用。因此，深入了解褐牙鲆早期發育階段CRH基因表達及甲狀腺激素的影響作用，對揭示褐牙鲆的生長發育機理具有重要意義。【前人研究進展】甲狀腺激素主要協助參與機體滲透壓調節、新陳代謝、皮膚色素沉著、生長發育和孵化后的形態等。Brown等（1987）研究證實，將硬骨魚類幼魚暴露在非常高劑量的外源甲狀腺素T3中數周，能普遍促進其生長發育及卵黃囊的吸收。Janz（2000）研究認為，與其他任何激素相比，甲狀腺激素對各組織的活力和生物功能影響更廣泛。Brown和Cai（2007）研究發現，在切除甲狀腺后蝌蚪幼體停止變態發育，但采用外源甲狀腺激素對其進行治療，蝌蚪幼體又重新生長發育至變態期。甲狀腺激素在魚類生長發育階段發揮重要作用，尤其在早期胚胎發育階段。Ishizuya-Oka（2011）研究認為，甲狀腺激素是兩棲動物自身重塑適應從水生到陸生生活及幼蟲器官/組織向成熟器官/組織轉變的必需激素。Kawakami等（2013）發現甲狀腺激素可通過甲狀腺激素受體控制日本鰻魚的早期生長發育，Stinckens等（2016）研究表明，在斑馬魚幼年階段破壞甲狀腺激素的合成可對其魚鰾產生影響。此外，有研究表明甲狀腺激素在類胚胎發育過程中對相關基因起調控作用，即佐證其對魚類早期胚胎發育也發揮著決定作用。Liu和Chan（2002）在斑馬魚胚胎中發現有TRa和TRb基因表達，且響應外源甲狀腺激素。Nelson和Habibi（2016）研究認為，甲狀腺激素可能影響金魚卵黃生成素的生成，但經外源甲狀腺素T3處理后只在雌性金魚中產生影響。【本研究切入點】在牙鲆的變態過程中甲狀腺激素發揮著重要作用，Miwa和Inui（1987）研究證實外源添加適量的甲狀腺激素可使牙鲆變態加快，且發現甲狀腺素T3的作用效果遠高于甲狀腺激素T4。但至今鮮見從基因角度揭示甲狀腺激素對牙鲆早期變態發育影響的研究報道。【擬解決的關鍵問題】探析褐牙鲆仔魚早期發育階段CRH基因的表達情況及受甲狀腺激素的影響作用，為開展牙鲆的人工繁育提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試褐牙鲆購自中國水產科學研究院北戴河中心實驗站，選用發育優良的雌、雄性親魚進行繁殖，授精和孵化用的自然海水（鹽度30‰）均經沙濾處理。受精卵孵化前5 d采用靜水孵化，之后以流水培育。孵化后2 d（2日齡）開始投喂褶皺臂尾輪蟲，20日齡后開始馴化人工配合餌料（鲆鰈鰨魚類專用料）。甲狀腺激素T3購自美國Sigma公司，先用二甲基亞砜（DMSO）進行溶解，再用海水稀釋至所需濃度（海水中DMSO為0.005%）。ELISA檢測試劑盒購自上海裕平生物科技有限公司。

1. 2 樣品采集與保存

選取1～8日齡褐牙鲆仔魚，每日齡取全魚20尾，在8～42日齡期間每隔2～5 d取樣一次，并按頭、身、尾分成3部分，以RNAfixer固定，用于CRH基因定量表達分析。每隔2 d選取19～40日齡仔魚樣品凍存，用于甲狀腺激素水平測定。同時選取22日齡褐牙鲆變態前仔魚為研究對象，甲狀腺激素T3設2個濃度梯度（5和50 nmol/L）和2個處理時間點（2和8 h），以未添加T3為空白對照組。每個時間點和濃度各取10尾仔魚用RNAfixer進行固定，用于CRH基因定量表達分析。

1. 3 組織RNA提取及反轉錄

參照RNAisoTM Plus操作說明，對取樣的褐牙鲆各組織進行總RNA提取及反轉錄合成cDNA模板。

1. 4 實時熒光定量PCR檢測分析

根據褐牙鲆CRH基因序列設計實時熒光定量PCR擴增引物（表1），并制作內參基因β-actin和目的基因的標準曲線。實時熒光定量PCR的反應體系20.0 μL：5倍梯度稀釋的cDNA模板2.0 μL，SYBR Premix Ex Taq（Tli RnaseH Plus）10.0 μL，正、反向引物各0.4 μL，RNase Free ddH2O 7.2 μL。擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，進行40個循環；隨后設計溶解曲線擴增期間檢測熒光信號，相應的擴增效率達96%～100%，R均大于0.99，且目的基因和內參基因的M相差小于0.10，隨后進行定量測定。采用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

1. 5 組織甲狀腺激素水平測定

將褐牙鲆仔魚加入適量生理鹽水研磨，1000×g離心10 min，吸取上清液，采用ELISA檢測組織中甲狀腺激素（T3和T4）水平。

1. 6 統計分析

采用GraphPad Prism v5.0進行單因素方差分析，并以Tukeys進行多重比較。

2 結果與分析

2. 1 褐牙鲆早期發育階段CRH基因的相對表達情況

由圖1可看出，1～8日齡褐牙鲆仔魚CRH基因的相對表達量呈先升高后降低的變化趨勢，在5日齡達最高值，顯著高于其他日齡的仔魚（P<0.05，下同）。10～42日齡褐牙鲆仔魚CRH基因主要集中在其頭部表達，但隨著生長發育的進程，其尾部的相對表達量逐漸增加，說明CRH基因可能對尾部神經系統的發育起重要調控作用。

2. 2 褐牙鲆早期發育階段甲狀腺激素水平變化

由圖2可看出，褐牙鲆仔魚甲狀腺素T4在變態前期（24日齡）的含量逐漸增加，變態高峰期（31日齡）迅速升高，在變態后期（37日齡）呈下降趨勢。甲狀腺素T3雖然在變態時期的含量高于其他早期發育時期，約是變態前的1.5倍，但含量低于甲狀腺素T4。甲狀腺軸產生的甲狀腺激素主要是T4，T3則是T4經脫碘轉化形成，需通過與核受體結合才能發揮生物學功能。

2. 3 外源T3對褐牙鲆早期發育階段CRH基因表達的影響

由圖3可看出，22日齡褐牙鲆仔魚經50 nmol/L外源T3處理2 h后，其頭部和尾部CRH基因的相對表達量均顯著升高；但以50 nmol/L外源T3處理8 h后，無論是頭部還是尾部，CRH基因的相對表達量均呈顯著的下降趨勢，可能是外源T3水平升高而引起甲狀腺激素負反饋作用。

3 討論

CRH是一個重要的神經內分泌多肽，控制應激誘導垂體促腎上腺皮質激素（ACTH）的分泌，從而促進彌散的腎間細胞合成皮質醇（Olivereau and Olivereau，1988；Tran et al.，1990；Mommsen et al.，1999）。在應激狀態下，CRH調節機體的HPA軸功能，協調機體的免疫、神經、內分泌、生理及行為學等反應（Fuzzen et al.，2011）。Pavlidis等（2011）研究發現，在第1次投喂褶皺臂尾輪蟲后褐牙鲆仔魚的CRH逐漸增加，其生活方式從內源向外源營養轉變。類似結果在日本鱸魚、花鱸等其他海洋硬骨魚上已得到印證（Pérez et al.，1999）。本研究于孵化后2 d（2日齡）開始對褐牙鲆仔魚投喂褶皺臂尾輪蟲，20日齡后開始馴化人工配合餌料（鲆鰈鰨魚類專用料），經實時熒光定量PCR檢測發現1～8日齡褐牙鲆仔魚CRH基因的相對表達量呈先升高后降低的變化趨勢，在5日齡達最高值，顯著高于其他日齡的仔魚，此時仔魚處于由內源性營養轉變為外源性營養階段，個體器官發育尚未完善，生理機能尚不成熟，對環境變化極其敏感，與Pérez等（1999）、Pavlidis等（2011）的研究結果相似。

機體內的糖皮質激素和甲狀腺激素在生活過渡階段起協同作用，調節其他激素的生物活性或組織對其他激素的敏感性（Bagamasbad and Denver，2011）。糖皮質激素通過影響脫碘酶活性及表達而調節組織對甲狀腺激素作用的敏感性，也可改變循環中甲狀腺激素的含量。Denver（1988）運用T4處理鯉魚后發現其下丘腦CRH結合蛋白（CRH-BP）水平提高了40%。Terrien等（2011）研究發現，在斑馬魚胚胎發育的最后一周糖皮質激素的上升會使其肝臟的3型脫碘酶活性下降，增加循環T3水平而誘導孵化。此外，CRH被認為是魚類HPT軸和HPA/HPI軸的一個共同調節因子，對ACTH和TSH分泌起調控作用，同時CRH和TSH對甲狀腺激素的合成起調控作用（De Groef et al.，2006）。本研究結果表明，經外源T3處理2 h后，褐牙鲆仔魚頭部和尾部的CRH基因表達量均有所升高，可能是短時間的應激反應能促使CRH分泌增加（Jiang et al.，2012）；但處理8 h后CRH基因相對表達量呈下降趨勢可能是長時間的外源T3作用引起負反饋作用（Shi et al.，2009）。Geven等（2009）研究表明，在鯉魚視前區T4可通過上調CRH結合蛋白的表達減少下丘腦分泌CRH；Lema等（2009）研究認為黑頭呆魚CRH基因表達上調與T4的減少相關；Mohácsik等（2016）研究發現HPT軸由下丘腦室旁核促腦垂體TRH-合成神經元控制甲狀腺激素的負反饋。可見，CRH基因表達上調可能歸因于下丘腦和垂體間的負反饋機制補償T4水平下降。

4 結論

褐牙鲆早期變態發育需CRH基因高表達及甲狀腺激素積累，二者對褐牙鲆早期變態發育階段具有重要作用并呈互相代償效應。

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（責任編輯 蘭宗寶）