葡萄MrRPV1蛋白LRR結構域的功能研究

曲俊杰　黃羽　盧江　尹玲

摘要：【目的】明確葡萄霜霉病抗性蛋白（MrRPV1）LRR結構域對葡萄霜霉菌特異性識別的影響，為進一步研究葡萄與霜霉菌間的互作機理打下基礎。【方法】將MrRPV1和白粉病抗性蛋白（MrRUN1）兩個蛋白的LRR結構域互換，構建重組表達載體后轉化至感霜霉病和白粉病的歐亞種西拉葡萄胚性愈傷組織中以獲得轉基因植株，并通過DNA、RNA分子水平檢測和室內接種試驗進行抗病性鑒定。【結果】共獲得7個RGA10-8LRR陽性轉基因（重組了MrRPV1蛋白LRR結構域）株系和6個RGA8-10LRR陽性轉基因（重組了MrRUN蛋白LRR結構域）株系。在7個RGA10-8LRR陽性轉基因株系中，僅RGA10-8-13陽性植株表現出與MrRPV1轉基因苗S8-1一致的壞死斑點，肉眼觀察不到白色霜霉狀物，但7個陽性轉基因系均未表現出明顯的白粉病抗性。在6個RGA8-10LRR陽性轉基因株系中，RGA8-10-3和RGA8-10-28兩個株系表現出對白粉病的抗性，有35%左右的細胞表現出細胞程序性壞死（PCD）；RGA8-10LRR轉基因苗均不抗霜霉病。【結論】MrRPV1的LRR結構域可能介導對葡萄霜霉菌的特異性識別，而MrRUN1的LRR結構域可能介導對白粉病菌的特異性識別。

關鍵詞： 葡萄；霜霉病抗性蛋白（MrRPV1）；白粉病抗性蛋白（MrRUN1）；LRR結構域；抗病性

中圖分類號： S663.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）02-0202-09

Abstract：【Objective】The function of LRR domain of grape downy mildew resistance protein（MrRPV1） in downy mildew pathogen specific recognition was investigated in order to provide basis for studying the interaction mechanism between grape and downy mildew pathogen. 【Method】The LRR domains of MrRPV1 and powdery mildew resistance protein（MrRUN1） were switched and recombinant expression plasmids were constructed in this study. The recombinant expression plasmids were transformed into embryonic callus of Shiraz grape which was susceptible to downy mildew and powdery mildew so as to obtain transgenic plants. Disease resistance of the transgenic plants was identified by DNA and RNA molecular level detection and indoor inoculation test. 【Result】In total， seven RGA10-8LRR（recombination of LRR domains of MrRPV1） and six RGA8-10LRR（recombination of LRR domains of MrRUN1） positive transgenic lines were obtained. Among the seven RGA10-8LRR transgenic lines， only RGA10-8-13 line exhibited similar necrotic spots to MrRPV1 transgenic plant S8-1 with no visible downy mildew. Furthermore， all the seven RGA10-8LRR transgenic lines showed no significant powdery mildew resistance. Powdery mildew resistance was observed in two RGA8-10LRR transgenic lines， namely RGA8-10-3 and RGA8-10-28， with programmed cell necrosis（PCD） in 35% cells. All the six RGA8-10LRR transgenic lines showed no downy mildew resistance. 【Conclusion】LRR domain of MrRPV1 may play a role in specific recognition of grape downy mildew pathogen and LRR domain of MrRUN1 may play a role in specific recognition of powdery mildew pathogen.

Key words： grape； downy mildew resistance protein（MrRPV1）； powdery mildew resistance protein（MrRUN1）； LRR domain； disease resistance

0 引言

【研究意義】葡萄霜霉病是葡萄生產上的常見病害之一，嚴重制約了葡萄與葡萄酒產業的可持續發展（王壯偉等，2015）。圓葉葡萄起源于美國東南部，具有優良的抗病性和抗蟲性，對霜霉病、皮爾斯病、根瘤蚜等病蟲害高抗甚至免疫，目前已通過圖位克隆從圓葉葡萄中克隆獲得霜霉病抗性基因MrRPV1（Feechan et al.，2013），但有關其介導霜霉病抗性的具體機制尚不清楚。因此，明確MrRPV1蛋白各結構域的功能，可為揭示霜霉病的抗性機理提供理論依據。【前人研究進展】富含亮氨酸的重復序列（Leucine-rich repeat，LRR）是植物抗病蛋白一個非常重要的結構域，該結構域在抗病蛋白識別病原菌效應因子和蛋白—蛋白相互作用中發揮重要作用（Qi and Innes，2013）。Jia等（2000）研究表明，水稻Pi-ta蛋白單獨的LRR結構域就能與對應的無毒蛋白Avr-Pita互作，與抗病品種相比，感病品種的Pi-ta基因在LRR結構域末端存在918A→S突變，且體內免疫共沉淀試驗也檢測到Avr-Pita與全長Pi-ta蛋白間的結合，為佐證LRR結構域與病原菌效應蛋白結合提供了證據支持。Tao等（2000）對擬南芥RPS2、RPM1及Dinesh-Kumar等（2000）對煙草N基因的研究表明，LRR結構域中單個氨基酸的改變就會導致抗病性喪失。Ellis等（2007）對亞麻銹病抗性蛋白的研究結果表明，LRR結構域是病原菌特異識別的主要決定因素。LRR結構域具有調節信號傳導的功能。如擬南芥RPS2、RPS5和RPP1A的LRR結構域缺失后，防御反應一直處于激活狀態（Tao et al.，2000；Michael Weaver et al.，2006）；過表達馬鈴薯Rx基因LRR結構域的截短蛋白可使超敏反應加強（Inohara et al.，2005），說明LRR結構域具有負調節抗性信號傳導的作用。此外，有研究表明LRR結構域中至少有2個區域對結合NBS區域實現抑制信號傳導發揮作用（Rairdan and Moffett，2006）。【本研究切入點】葡萄霜霉病抗性蛋白MrRPV1和白粉病抗性蛋白MrRUN1均屬于典型的TIR-NBS-LRR類型，二者在染色體的同一個位點上，且氨基酸水平具有86%的相似性，主要差別在于羧基端LRR的重復數不同（Feechan et al.，2013）。其中，MrRPV1含有20個LRR重復，MrRUN1含有16個LRR重復，但二者較高的序列同源性和功能差異是否能通過結構域交換確定其對病原菌的特異識別尚需進一步驗證。【擬解決的關鍵問題】利用結構域互換技術對MrRPV1蛋白LRR結構域的功能進行研究，旨在明確LRR結構域對葡萄霜霉菌特異性識別的影響，為進一步研究葡萄與霜霉菌間的互作機理打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 植物材料、載體及菌株

西拉葡萄胚性愈傷組織（以花藥經組織培養誘導獲得）由澳大利亞聯邦科學與工業組織Ian Dry博士實驗室保存提供；霜霉菌為田間采集的混合菌；MrRPV1轉基因苗S8-1和MrRUN1轉基因苗S10-11參照Feechan等（2013）的研究方法制備，受體材料均為西拉葡萄；攜帶pCLB2301-RGA8_RGA10_SK（#1310）和pCLB2301-RGA10_RGA8_SK（#1311）質粒的農桿菌菌株EHA105也由Ian Dry博士實驗室保存提供，該載體中RGA8即為MrRPV1、RGA10即為MrRUN1。

1. 2 農桿菌介導的葡萄胚性愈傷組織遺傳轉化

農桿菌介導葡萄胚性愈傷組織遺傳轉化過程所需的培養基均參考Bouquet等（2006）的方法配制，其他操作步驟如下：

1. 2. 1 菌液活化 將含有目的質粒的農桿菌菌株接種在含利福平（25 μg/mL）、卡那霉素（100 μg/mL）的MG/L培養基上，28 ℃培養2 d，進行菌株活化以獲得單菌落。挑取單菌落接種于含抗生素的MG/L培養基中（3.0 mL），28 ℃下搖床（220 r/min）培養過夜。取10 μL過夜培養物接種于含卡那霉素的MG/L培養基中（25.0 mL），28 ℃下搖床（220 r/min）培養過夜，進行擴大培養。測定上述培養物的OD600，待OD600達0.8～1.0時，5000 r/min離心8 min，收集菌體，用25.0 mL LCM培養基重懸，28 ℃搖床（220 r/min）培養3 h。

1. 2. 2 農桿菌侵染 從GS1CA培養基中收集胚性愈傷組織置于新的培養皿中，吸掉多余水分。將3.0 mL農桿菌菌液滴于胚性愈傷組織上進行侵染，10 min后用無菌濾紙吸掉多余菌液。

1. 2. 3 共培養 將侵染后的愈傷組織均勻鋪在新的培養皿中，培養皿預先鋪好用GS1CA液體培養基完全浸濕的3層濾紙，封口膜封好培養皿，22 ℃暗培養48 h。收集并用含1000 μg/mL特美汀的LCM液體培養基洗滌胚性愈傷組織，篩網過濾收集愈傷組織，轉移至含1000 μg/mL特美汀的GS1CA培養基上，28 ℃暗培養9～10 d。

1. 2. 4 繼代培養 將胚性愈傷組織轉移至含1000 μg/mL特美汀和100 μg/mL卡那霉素的GS1CA培養基上，28 ℃繼續暗培養。

1. 2. 5 篩選培養 4周后將繼代培養后的愈傷組織轉移至含1000 μg/mL特美汀和100 μg/mL卡那霉素的NN篩選培養基上，28 ℃繼續暗培養。每隔3～4周繼代一次，直至萌發出子葉型胚狀體。

1. 2. 6 陽性胚狀體篩選 將開始萌發的子葉型胚狀體放置在熒光體視顯微鏡下觀察GFP熒光，篩選出陽性胚狀體。

1. 2. 7 陽性胚狀體培養 將具有GFP熒光的萌發陽性子葉型胚狀體轉移至含2 mol/L 6-芐基腺嘌呤（BAP）的1/2MS培養基上光照培養，繼續萌發至真葉產生；然后轉移至不含激素的1/2MS培養基上繼續培養。

1. 2. 8 生根培養 將生長至一定程度的小植株轉移至生根培養基上進行生根培養，待根部萌發生根后轉移至土壤中，置于溫室中培養。

1. 3 轉基因陽性苗鑒定

1. 3. 1 報告基因GFP熒光觀察 向土壤中轉移植株前在熒光體視顯微鏡下觀察葉片和根部的GFP熒光，能觀察到GFP熒光的植株初步確定為陽性苗，用于下一步鑒定。

1. 3. 2 DNA水平鑒定 采用CTAB法提取GFP陽性植株葉片的基因組DNA（Zhang et al.，1998），再以MrRPV1和MrRUN1基因各自的特異引物（表1）檢測轉基因植株中的基因重組情況。重組了MrRPV1蛋白LRR結構域的植株命名為RGA10-8LRR植株，重組了MrRUN1蛋白LRR結構域的植株命名為RGA8-10LRR植株。RGA10-8LRR陽性植株DNA水平鑒定選用3對特異引物，其中，RGA10部分采用MrRUN1基因的特異引物對AJ87/AJ88擴增RGA10前段，擴增產物為504 bp，同時設4個對照，pCLB2301-RGA10_RGA8_SK（#1311）質粒為陽性對照，RGA8-10LRR轉基因植株RGA8-10-1a葉片、未轉基因的西拉葡萄葉片和水為陰性對照；重組LRR部分采用MrRPV1基因的特異引物對CB600/CB632和CB627F/CB622R分別擴增其前段和后段，擴增產物分別為200和337 bp。RGA8-10LRR陽性植株DNA水平鑒定選用4對特異引物，其中，RGA8部分采用MrRPV1基因的特異引物對CB578/CB581擴增RGA8前段，引物對CB438/CB437擴增RGA8前后段，擴增產物分別為150和400 bp，同時設4個對照，pCLB2301-RGA8_RGA10_SK（#1310）質粒為陽性對照，RGA10-8LRR轉基因植株RGA10-8-3葉片、未轉基因的西拉葡萄葉片和水為陰性對照；重組LRR部分則采用MrRUN1基因的特異引物對CB564/CB181和CB629F/CB630R分別擴增其前段和后段。

1. 3. 3 RNA水平鑒定 使用Spectrum Plant Total RNA Kit提取GFP陽性植株葉片RNA，NanoDrop ND-1000分光光度計測定提取RNA的純度和濃度。使用SuperScript VILOTM cDNA Synthesis Kit對RNA進行反轉錄，獲得cDNA，再以MrRPV1和MrRUN1基因各自的特異引物進行重組基因表達情況PCR檢測。RGA10-8LRR陽性植株RNA水平鑒定選用2對引物，RGA10部分采用引物對CB20/CB632，RGA8LRR部分采用引物對CB631/CB568，其中CB568是MrRPV1的特異引物。RGA8-10LRR陽性植株RNA水平鑒定也選用2對引物，RGA8部分采用引物對CB20/CB632，RGA10LRR部分采用引物對CB631/CB556，其中CB556是MrRUN1的特異引物。

1. 4 霜霉病和白粉病抗性鑒定

葡萄霜霉病抗性鑒定采用葉盤接種法，具體操作方法：選取完全伸展開的葡萄葉片，以去離子水清洗后晾干備用；用打孔器將葉片打成直徑1 cm的葉盤（避開主葉脈和較大側葉脈），葉背面朝上放置在鋪有濕潤無菌濾紙的培養皿中；每個葉盤上滴加35 μL霜霉菌孢子囊懸液（5×104孢子囊/mL），以MrRPV1轉基因苗S8-1及其受體材料感病歐亞種西拉葡萄分別為抗、感霜霉病對照，同時以無菌水接種RGA10-8LRR為陰性對照；葉盤在光照培養箱（溫度22 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗）中培養24 h后吸取多余的水分和菌液，接種4～5 d后觀察發病情況。霜霉菌孢子數統計：每個試驗組和對照組的葉盤均用等體積無菌水洗脫，吸取10 μL洗脫后的孢子懸液，小心滴加到血球計數板上進行計數。重復3次。采用 t 檢驗進行差異顯著性分析。

葡萄白粉病抗性鑒定采用離體葉片接種法，具體操作方法：采集溫室盆栽的轉基因苗幼嫩葉片，按照Feechan等（2011）的方法接種葡萄白粉病菌菌株，48 h后對接種葉片進行臺盼藍染色，觀察附著胞、吸器、菌絲及細胞程序性壞死（Programmed cell death，PCD）的產生情況，對抗性進行評估。將觀察到吸器和延伸次生菌絲（Elongating secondary hyphae，ESH）結構的細胞定義為被病菌成功入侵（Penetration，PEN）細胞。以每次成功入侵引起的PCD為抗性標志，計算PCD出現頻率。PCD出現頻率越高，抗性越強，反之則抗性越弱。

1. 5 統計分析

采用Students t-test進行統計分析。

2 結果與分析

2. 1 陽性轉基因植株的獲得及鑒定結果

采用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化西拉葡萄胚性愈傷組織，約歷時一年才獲得轉基因植株（圖1），轉移至溫室培養。篩選培養基上萌發的西拉葡萄體細胞胚在熒光體視顯微鏡下觀察，其子葉、胚軸、胚根均能觀察到GFP熒光，將GFP陽性萌發體細胞胚轉移至含2 μmol/L BAP的1/2MS培養基上光照培養，直至長出至少1片真葉，再轉移至1/2MS培養基上繼續培養，無菌條件下采集一小片轉基因植株葉片，制成切片，在共聚焦顯微鏡下觀察葉片GFP熒光。將獲得的GFP陽性莖段轉移至生根培養基上獲得完整植株，在熒光體視顯微鏡下可觀察到根部GFP熒光，將所有根部可觀察到GFP熒光的植株轉移至土壤中，煉苗后置于溫室中繼續生長。

RGA10-8LRR陽性植株DNA水平鑒定結果如圖2所示。在所鑒定的15個轉基因株系中，有10個株系的擴增結果與陽性對照pCLB2301-RGA10_RGA8_SK（#1311）質粒的產物大小一致，被鑒定為陽性轉基因苗。據Feechan等（2013）的研究結果可知，在MrRPV1和MrRUN1兩個基因的第二個外顯子處存在選擇性剪切，在MrRPV1和MrRUN1轉基因苗體內存在4個不同的轉錄本。由于本研究構建的重組載體是采用基因自身的啟動子，因此RNA水平鑒定應檢測到4個轉錄本，即在RT-PCR產物中存在對應的4條電泳條帶（圖3-A），條帶大小分別為2.00、1.20、1.00和0.80 kb。RGA8 LRR部分對應的擴增產物為2.10 kb（圖3-B），RGA10-8-43未檢測到轉錄本，RGA10-8-7檢測到2個轉錄本，RGA10- 8-19檢測到3個轉錄本，其他株系均檢測到4個轉錄本，其中第3個轉錄本的表達量較低。綜合以上鑒定結果，本研究共獲得7個RGA10-8LRR陽性轉基因株系。

RGA8-10LRR陽性植株DNA水平鑒定結果如圖4所示。在所鑒定的8個轉基因株系中，有7個株系的擴增結果與陽性對照一致，被鑒定為陽性轉基因苗。RGA8-10-2株系與陰性對照一致，未擴增出目的片段，被鑒定為假陽性植株。同上，RGA8-10LRR陽性植株的RGA8部分也應該檢測到4個轉錄本，即在RT-PCR產物中存在對應的4條電泳條帶（圖5-A），條帶大小分別為2.00、1.20、1.00和0.80 kb。RGA10LRR部分采用引物對CB631/CB556的擴增產物為1.68 kb（圖5-B），RGA8-10-39株系未擴增出目的片段。綜合以上鑒定結果，本研究共獲得6個RGA8-10LRR陽性轉基因株系。

2. 2 RGA10-8LRR陽性植株的霜霉病抗性鑒定結果

對RGA10-8LRR陽性植株進行葡萄霜霉病菌接種，檢測結構域互換后的轉基因苗是否具有霜霉菌抗性。結果表明，RGA10-8-13植株表現出與MrRPV1轉基因苗S8-1一致的壞死斑點，肉眼觀察不到白色霜霉狀物，而未轉基因的西拉葡萄表現出明顯的感病癥狀，葉盤表面長滿白色霜霉（圖6）。雖然其他6個陽性轉基因系未觀察到壞死斑，但可觀察到明顯的白色霜霉狀物，對其葉盤進行霜霉菌孢子囊計數，結果發現轉基因植株每個葉盤上的霜霉菌孢子囊數與西拉葡萄相比均呈顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01，下同）的下降趨勢（圖7）。而白粉病的抗性鑒定結果表明，與MrRUN1轉基因苗S10-11相比，RGA10-8LRR轉基因苗均未表現出明顯的白粉病抗性（圖8）。可見，互換后的LRR結構域在一定程度上發揮了病原菌識別作用。

2. 3 RGA8-10LRR陽性植株的白粉病抗性鑒定結果

對GFP熒光觀察及DNA和RNA水平檢測均呈陽性的6個RGA8-10LRR株系進行葡萄白粉病菌接種，檢測LRR結構域互換后的轉基因苗對白粉病菌是否具有抗性，結果發現RGA8-10-3和RGA8-10-28兩個株系表現出對白粉病的抗性，有35%左右的細胞表現出PCD（圖9），與未轉基因的西拉葡萄對照相比存在極顯著差異，但其他4個株系與未轉基因的西拉葡萄對照間無顯著差異（P>0.05），未表現出白粉病抗性；同時發現LRR結構域重組后的轉基因苗對白粉病菌的抗性較MrRUN1轉基因苗的抗性有所降低。霜霉病接種試驗結果發現，RGA8-10LRR轉基因苗均不抗霜霉病（圖10）。表明MrRPV1的LRR結構域被MrRUN1的LRR結構域互換后，在一定程度上起到對白粉病菌的識別作用，但不再介導霜霉病抗性。

3 討論

植物基因組中存在大量的抗性基因（R基因）以對抗多種多樣的病原菌。其中，NBS-LRR類抗病基因是植物抗病基因中主要大類，也是近年來植物抗病基因研究的熱點。在NBS-LRR類抗病基因中，LRR結構域直接或間接與病原菌的無毒蛋白（AVR）互作（Jia et al.，2000；Dangl and Jones，2001），因此被認為與病原菌的特異識別有關（Ellis et al.，1999；van der Hoorn et al.，2005）。本研究將MrRPV1和MrRUN1兩個蛋白的LRR結構域互換，構建重組表達載體，成功轉化西拉葡萄的胚性愈傷組織而獲得轉基因植株，并通過DNA、RNA分子水平檢測和室內接種試驗進行抗病性鑒定，篩選出具有抗性性狀的轉基因株系。這些抗性植株的存在說明MrRPV1和MrRUN1兩個抗性蛋白的LRR結構域可能分別介導對白粉病菌和霜霉病菌的特異性識別。本研究還發現，雖然有些轉基因株系的PCR檢測結果呈陽性，但其并未具有白粉病或霜霉病抗性或抗性與對照相比有所降低。這種現象在其他一些轉基因植物（煙草和亞麻）上也曾經觀察到（Dinesh-

Kumar et al.，2000；Ellis et al.，2007），其原因主要是：（1）重組后的目的蛋白在某些PCR檢測呈陽性的轉基因植株體內并未表達。在本研究中，重組蛋白和GFP標簽相對獨立，二者并非融合蛋白，因此無法使用GFP抗體檢測目的蛋白的表達情況。同時，NB-LRR類蛋白在植物體內存在很多的同源基因，且大部分位置均較保守，根據目的蛋白設計特異抗體檢測其表達情況的技術尚未成熟。（2）轉基因植株的抗病性差異可能與轉基因的拷貝數有關。Goodwin等（1996）、郭興啟（2001）研究發現，轉基因的拷貝數與轉基因植株的抗性呈正相關。因此，在今后的相關研究中宜通過Southern雜交技術檢測轉基因苗的拷貝數。（3）重組外源基因在基因組中的插入位點不穩定，外源基因整合進目的植物基因組后，極易被植物基因組存在的修飾與限制系統所識別并加以修飾和抑制，使之失活或沉默（Kumpatla et al.，1998）。如果轉基因整合進入高度甲基化的染色體區域，其甲基化作用就會波及轉基因效果，使目的基因轉錄失活；若整合到異染色質區或高度重復序列區，則會導致目的基因的表達沉默或下降（夏蘭芹等，2000）。

4 結論

MrRPV1的LRR結構域可能介導對葡萄霜霉菌的特異性識別，而MrRUN1的LRR結構域可能介導對白粉病菌的特異性識別。

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（責任編輯 蘭宗寶）