藍豬耳大孢子發生和雌配子體發育

陳素紅 鄒璞 廖景平

摘要[目的]研究藍豬耳大孢子發生和雌配子體發育。[方法]采用常規石蠟切片和超薄切片技術研究藍豬耳大孢子發生和雌配子體發育過程。[結果]藍豬耳為中軸胎座，倒生胚珠，單珠被，薄珠心。大孢子母細胞減數分裂形成T-形和直線形四分體。T-形四分體合點端大孢子具功能，胚囊為蓼型發育形式；直線形四分體中珠孔端大孢子具功能，最終形成八核七細胞的成熟胚囊。胚囊發育異常偶有發生，但大部分胚囊都能發育成正常的7-細胞胚囊。[結論]藍豬耳雌性生殖細胞發育異常并不是其結實率低的主要原因。

關鍵詞藍豬耳；大孢子發生；雌配子體形成

中圖分類號S188+2文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）20-0128-03

Abstract[Objective]To study megasporogenesis and female gametophyte development of T. fournieri.[Method]Megasporogenesis and female gametophyte development of T.fournieri were investigated by techniques of paraffin sections and ultrathin sections.[Result] T.fournieri had axile placenta.The ovule was anatropous，unitegmic and tenuinucellatae.The megasporocyte divided into Ttetrad or linear tetrad after meiosis.The chalazal end megaspore was functional in Ttetrad and the embryo sac was the polygonum type.However，the micropyle end megaspore was functional in linear tetrad.The mature embryo sac was 7celled and 8nucleate type.Abnormal embryo sac was observed by chance，but most of the embryo sacs could develop normally.[Conclusion]The abnormal development of female germ cells wasnt a crucial factor for the low setting rate of Torenia fournieri.

Key wordsTorenia fournieri；Megasporogenesis；Female gametophyte development

藍豬耳（Torenia fournieri Linden.Ex Foum.）是玄參科（Scrophulariaceae）蝴蝶草屬一年生直立草本植物。現栽培種花色鮮艷，是夏季優良草花盆栽觀賞花卉之一。它花期長、花量大，還具有半裸露胚囊，因而被作為研究被子植物受精生物學的理想模式植物[1]。

數十年來，借助藍豬耳特殊的胚囊結構，研究多集中在花粉管生長、受精前后發育過程、離體受精體系建立等[2-10]，而有關藍豬耳胚胎學的研究較少。Vivian等[11]著重研究了藍豬耳胚和胚乳的發育，以及胚乳的吸器、營養功能與成熟種子形成的關系。Tiwari[12-13]報道了藍豬耳成熟胚囊中有胼胝質壁的出現，通過組織化學法研究了承珠盤的細胞壁。Wallwork等[14]研究了藍豬耳授粉后至受精前胚囊內細胞結構的變化。目前，有關藍豬耳大孢子發生和雌配子體發育的研究少見報道。筆者研究了藍豬耳大孢子發生和雌配子體發育過程，探討了藍豬耳半裸露胚囊的形成和栽培種結實率不高的原因，為藍豬耳的胚胎學研究積累資料。

1材料與方法

試驗材料為中國科學院華南植物園種植的藍豬耳。用卡尺測量不同發育時期的花苞，按花苞長度和開放狀態分別放于FAA液中固定，抽氣。愛氏蘇木精整體染色，常規石蠟切片，厚度8 μm 。用OlympusAX70 光學顯微鏡觀察和OlympusDP50數碼拍照。

光鏡下確定發育時期，選取主要時期的胚珠固定于1%戊二醛（0.1 mol/L磷酸緩沖液配制，pH 7.2）中，4 ℃下12～24 h。用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2）洗滌后轉入1%鋨酸（0.1 mol/L磷酸緩沖液配制，pH 7.2）中固定，4 ℃下16 h。再用上述緩沖液沖洗后經各級乙醇脫水，環氧丙烷置換，Epon 812環氧樹脂滲透并包埋。包埋塊在半薄切片機上用玻璃刀切片，厚度為1～2 μm，0.5%甲苯胺藍溶液染色，光學顯微鏡下觀察、定位，LK-S型超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，在日本JEM-1010透射電鏡100 kV下觀察、拍照。

2結果與分析

2.1胚珠的發育與大孢子發生

藍豬耳為中軸胎座，子房室中有上百個胚珠，其中胚珠的發育基本是同步的。當心皮原基腹縫線開始連合后，胎座部位細胞的細胞質變得濃厚并開始迅速分裂分化，向子房腔內迅速隆起形成圓球形的胚珠原基（圖1a）。

藍豬耳胚珠倒生，單珠被，薄珠心。當珠被剛包圍珠心時，珠孔端珠心組織表皮下分化出一個體積較大、細胞質濃、細胞核顯著的細胞，即孢原細胞。孢原細胞直接發育為大孢子母細胞，大孢子母細胞的體積比孢原細胞更大，細胞質更濃，細胞器豐富（圖1b）。單層的珠心表皮細胞沒有進一步分裂分化，而是在減數分裂時期開始解體，到功能大孢子時期珠孔端只留下一些退化的痕跡（圖1c），藍豬耳胚珠為薄珠心胚珠。藍豬耳胚珠屬單珠被胚珠，功能大孢子時期珠被細胞具有3～4層細胞（圖1d）。與此同時，由于胚珠基部的不均衡生長，導致珠柄彎向一側，在功能大孢子形成時完全倒轉形成倒生胚珠。大孢子母細胞進行減數分裂后形成四分體，四分體的4個大孢子排列方式多數為直線形，少數為T-形。在T-形四分體中，靠近珠孔端的3個大孢子同時解體消失，只有合點端的大孢子保留，即功能大孢子（圖1e）。在直線形四分體中，靠近合點端的3個大孢子逐個解體消失，只有珠孔端的大孢子保留，成為功能大孢子（圖1f）。藍豬耳以單孢子胚囊的發育方式進一步發育為成熟胚囊。

2.2雌配子體發育

減數分裂完成后，功能大孢子與其他3個分離，細胞膨大，細胞質濃厚，細胞核顯著。功能大孢子繼續發育形成單核胚囊，單核胚囊的體積進一步增大，進行第1次有絲分裂，形成二核胚囊。二核胚囊初期，胚囊隨著大量的小液泡出現而體積增大；之后2個核分別向胚囊兩極移動，中間被大液泡隔開，但兩核之間有細胞質相連。接著，兩核各自進行1次有絲分裂，形成四核胚囊，此時可觀察到被珠被包被的珠心表皮細胞退化留下的痕跡（圖1g）。隨著核的分裂，胚囊逐漸拉長并出現大液泡化，四核同時進行1次有絲分裂形成八核胚囊，在靠珠孔端有4個核，在合點端也有4個核，8個核處于共同的細胞質中。在八核胚囊時期，合點端有2個核出現退化現象，核變形，染色變黑（圖1h）。接著發生細胞化，在珠孔端的4個核有3個組成卵器，包含1個卵細胞和2個助細胞；在合點端的4個核有2個形成反足細胞；珠孔端的上極核和合點端的下極核共同構成含2個核的中央細胞。這2個極核融合形成次生核。這樣，形成八核七細胞的成熟胚囊。

藍豬耳成熟胚囊半裸露于珠孔端，卵器和部分中央細胞清晰可見（圖2a）。卵細胞內有大液泡，細胞核與細胞質大部分位于細胞的合點端，較大的液泡則位于珠孔端；2個助細胞和卵細胞呈“品”字型排列，2個助細胞的核和大部分細胞質都分布在珠孔端（圖2b）。中央細胞中2個極核距離較近，位于胚囊的中心位置（圖2c）。當胚囊發育成熟，2個極核融合成的次生核有向珠孔端移動的趨勢，中央細胞的核和核仁與卵細胞的相比都較大（圖2d）。3個反足細胞呈“品”字型排列，細胞為長橢圓形（圖2e）。

3討論

Vivian等[11]簡要報道了藍豬耳雌配子體發育特征，顯示大孢子母細胞減數分裂后成4個大孢子，合點端的一個行使功能最終發育成雌配子體，然而該研究結果與之不同。該研究顯示：胚囊發育為單孢子型，當大孢子減數分裂后為T-形四分體時，胚囊為蓼型發育形式，成熟胚囊為八核七細胞；當大孢子減數分裂后為直線形四分體時，珠孔端第1個大孢子為功能大孢子，其他3個逐個退化，最終成熟胚囊仍為八核七細胞。藍豬耳胚囊發育特征有待進一步研究。

從花苞外部形態與內部大、小孢子發生及雌、雄配子體發育情況比較（表1）可見，藍豬耳花蕾不大，生殖器官發育所經歷的時間不長，但雌蕊與雄蕊發育進程是不同步的。早期雄蕊的發育快于雌蕊，但胚囊后期發育進程快，使得雌、雄性生殖細胞在開花時基本同時達到成熟階段。

植物開花后所產生的成熟果實比所開的花少，而果實中成熟種子數比胚珠數少許多，這既是環境條件對植物進行選擇的結果，也是植物對有限環境資源適應的結果[16]。許多植物不能正常地繁衍后代，很重要的原因之一是植物有性生殖過程的某些環節出現了障礙[17-18]。筆者研究了藍豬耳雌配子體發育情況，發現在胚囊形成的過程中有異常現象發生，但經過大量

切片統計，胚囊不能正常發育的數量很少，大部分都能發育成正常的7-細胞胚囊。因此，認為藍豬耳雌性生殖細胞發育異常并不是其結實率低的主要原因。

參考文獻

[1]

陳素紅，田惠橋，廖景平.藍豬耳受精生物學研究進展[J].熱帶亞熱帶植物學報，2006，14（6）： 532-538.

[2]

陳素紅，楊延紅，廖景平，等.藍豬耳卵細胞和合子的分離[J].植物生理與分子生物學學報，2005，31（4）：383-388.

[3] CHEN S H，LIAO J P，KUANG A X，et al.Isolation of two populations of sperm cells from the pollen tube of Torenia fournieri[J].Plant Cell Rep，2006，25（11）：1138-1142.

[4] HIGASHIYAMA T，KUROIWA H，KAWANO S，et al.Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri[J].Plant cell，1998，10（12）：2019-2031.

[5] HIGASHIYAMA T，KUROIWA H，KAWANO S，et al.Pollen tube attraction by the synergid cell[J].Science，2001，293：1480-1483.

[6] HAN Y Z，HUANG B Q，ZEE S Y，et al.Symplastic communication between the central cell and the egg apparatus cells in the embryo sac of Torenia fournieri lind.before and during fertilization[J].Planta，2000，211（1）：158-162.

[7] HAN Y Z，HUANG B Q，GUO F L，et al.Sperm extract and inositol 1，4，5-triphosphate induce cytosolic calcium rise in the central cell of Torenia fournieri[J].Sex Plant Reprod，2002，15（4）：187-193.

[8] YUAN M，FU Y，WANG F，et al.Fertilization in Torenia fournieri：Actin organization and nuclear behavior in the central cell and primary endosperm[J].Science in China （Life sciences），2002，45（2）：211-224.

[9] 吳娟子.藍豬耳花粉管細胞壁超微結構的FESEM和AFM比較研究[J].安徽農業科學，2011，39（35）：21802-21804.

[10] 于金金，成誠，王雅英，等.藍豬耳離體受精初試[J].植物生理學報，2012，48（10）：1015-1020.

[11] VIVIAN B G，EMMA L F.Megasporogenesis and seed development in Mimulus tigrinus and Torenia fournieri[J].Bull Tor Bot Club，1951，79（1）：6-24.

[12] TIWARI S C.Callose in the walls of mature embryo sac of Torenia fournieri[J].Protoplasma，1982，110（1）：1-4.

[13] TIWARI S C.The hypostase in Torenia fournieri Lind.：A histochemical study of the cell walls[J].Ann Bot，1983，51（1）：17-26.

[14] WALLWORK M A B，SEDGLEY M.Early events in the penetration of the embryo sac in Torenia fournieri（Lind.）[J].Ann Bot，2000，85（4）：447-454.

[15] 陳素紅，鄒璞，廖景平.藍豬耳小孢子發生和雄配子體發育[J].熱帶亞熱帶植物學報，2010，18（2）：122-128.

[16] CHARLESWORTH D.Why do plants produce so many more ovules than seeds？[J].Nature，1989，338：21-22.

[17] 劉林德，王仲禮，田國偉，等.刺五加大、小孢子發生和雌、雄配子發育的觀察[J].植物分類學報，1998，36（4）：289-297.

[18] 潘躍芝，龔洵.瀕危植物紅花木蓮大孢子發生和雌配子體發育的研究[J].西北植物學報，2002，22 （5）：1209-1214.