響應面法優化菠蘿皮渣酵素的發酵工藝

南竹 曹博恒

摘要[目的]利用乳酸菌發酵菠蘿皮渣制備菠蘿皮渣酵素。[方法]以蛋白酶活性為指標，運用Box-Behnken Design 8.0.5v響應面法優化制作菠蘿皮渣酵素的工藝參數。[結果]菠蘿皮渣酵素制備的最佳工藝條件為發酵溫度23 ℃，酵母菌接種量0.3%，發酵時間16.5 h。按上述工藝制得的菠蘿皮渣酵素顏色均勻，酸甜適口并伴有發酵香味，有光澤。[結論]研究可為菠蘿副產物的綜合開發利用提供理論依據。

關鍵詞菠蘿皮渣；酵素；響應面法；發酵

中圖分類號TS255文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）20-0098-03

Abstract[Objective] Preparation of pineapple peel enzyme by fermentation of pineapple peel with lactic acid bacteria .[Method]The process parameters of pineapple peel were optimized by BoxBehnken Design 8.0.5v response surface method using protease activity as an index.[Result] The optimum conditions were as follows： the fermentation temperature was 23 ℃， the inoculation amount of yeast was 0.3%， the fermentation time was 16.5 h.According to the above process made of pineapple skin residue enzyme color uniform， sweet and sour taste and accompanied by fermentation fragrance， shiny.[Conclusion] The study can provide a theoretical basis for the comprehensive utilization of pineapple byproducts.

Key wordsPineapple peel；Enzyme；Response surface method；Fermentation

菠蘿皮渣是菠蘿鮮食或生產加工后的副產物，約占全果重量的50%。研究顯示，菠蘿皮渣中的營養成分比例與果肉相差并不多[1]。目前菠蘿生產過程中產生的皮渣多被廢棄，不僅污染環境，同時浪費了大量的生物資源。如果對菠蘿皮渣進一步加工制成菠蘿皮渣酵素，它的經濟價值會大大提高，并且可為菠蘿副產物的綜合利用開辟新的途徑。

酵素又稱作酶，是一種具有催化作用的大分子物質，深受日本及我國臺灣地區人民喜愛的一種植物功能食品。酵素中含有豐富的礦物質、維生素、低聚糖、多酚、黃酮、酶和次生代謝產物等營養成分，具有美白抗氧化、抗菌消炎、潤腸通便、解酒護肝、增強機體免疫力、修復機體損傷等保健功能[2-5]。但目前國內關于菠蘿酵素的介紹和研究并不多見。筆者以加工生產后的廢棄物菠蘿皮渣為原料，利用酵母菌發酵制備菠蘿皮渣酵素，探究制備的工藝條件，為菠蘿的副產物綜合利用以及以后的規模化生產提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料與主要試劑。

菠蘿皮渣，購置于農貿市場，低溫保存；果酒專用酵母，安琪酵母股份有限公司；乳酸菌，錦州醫科大學醫療學院形態實驗中心。

1.1.2儀器設備。

CR21G高速冷凍離心機，日本日立公司；泰光 906200 手持式折光儀，河北潤聯科技開發有限公司；TU-1810 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；HZP-250 型全溫振蕩培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；血球計數板，上海市求精生化試劑儀器有限公司；真空冷凍干燥機，沈陽航天新陽速凍設備制造有限公司。

1.2工藝流程

菠蘿皮渣→酶解→滅菌→接種+酵母菌發酵→濃縮→真空冷凍干燥→菠蘿皮渣酵素→包裝。

1.3操作要點

1.3.1酶解。將菠蘿皮渣用果膠酶及纖維素酶進行酶解，水解后生成了便于吸收和利用的小分子糖類[6-7]。酶解工藝條件如下：pH 4.5，料液比1∶5（g∶mL），溫度為 55 ℃，酶解時間160 min。加酶量為纖維素加酶量1.5%，果膠酶加酶量1.0%。菠蘿皮渣酶解率為63.50%，可溶性固形物含量為6.23%。

1.3.2

酵母菌的活化和培養。用0.5 mL的生理鹽水溶解酵母菌粉，使菌體溶解成懸浮液狀態，然后將菌液在YPD培養基上進行涂布，在30 ℃恒溫培養箱內培養2～3 d。菌種經過冷凍干燥后，生長延遲期較長，故需經過2次繼代培養，菌液待用[8]。

1.3.3發酵液的制備。

將酶解液濃縮至可溶性固形物含量為25%[9]，適量補充營養物質。

1.3.4接種和發酵。設置溫度26 ℃，pH 5.0條件下，接種0.3%酵母菌到發酵液，酵母菌初始活菌數為3.28×105 CFU/mL左右，發酵20 h。最后保持溫度在18～20 ℃，靜置24 h，進行后發酵，使發酵液產香[10]。

1.3.5真空冷凍干燥。

將發酵液可溶性固形物含量濃縮到45%，通過真空冷凍干燥得到水分含量小于4%的菠蘿皮渣酵素粉。在冷凍溫度為-20 ℃，真空度為10～20 Pa，冷阱溫度為-45 ℃的條件下進行真空冷凍干燥[11]。

1.4酵母菌發酵單因素試驗

1.4.1發酵溫度的確定。

發酵溫度的高低會直接影響酵母菌的生長繁殖和發酵產物的生成。菠蘿皮渣發酵液要充分溶氧，并設置酵母菌接種量0.3%，分別在20、22、24、26、28 ℃下進行發酵，發酵時間20 h。發酵結束后測定蛋白酶活性，以確定最適的酵母菌發酵溫度。

1.4.2起始pH的確定。

菠蘿發酵液自身的pH在4.6左右，試驗用到的葡萄酒酵母在微酸性環境下適宜生長。菠蘿皮渣發酵液在充分溶氧的條件下，控制發酵溫度為24 ℃，酵母菌接種量為0.3%，用CaCO3調節發酵液酸度，使pH分別在4.8、5.0、5.2、5.4、5.6 條件下進行發酵，發酵時間為20 h。發酵結束后測定蛋白酶活性，以確定最適的發酵起始pH。

1.4.3接種量的確定。

發酵液發酵的速度會隨著接種量的不同而變化，并進一步影響了發酵產物的品質。菠蘿皮渣發酵液在充分溶氧的條件下，控制發酵溫度為24 ℃，pH為5.2，分別接種0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%酵母菌進行發酵，發酵時間為20 h。發酵結束后測定蛋白酶活性，以確定最適的酵母菌接種量。

1.4.4發酵時間的確定。

菠蘿皮渣發酵液在充分溶氧的條件下，控制發酵溫度為24 ℃，酵母菌接種量為0.3%，pH為5.2，發酵時間分別設置為10、15、20、25、30 h。發酵結束后測定蛋白酶活性，以確定最適的發酵時間。

1.5響應面試驗

在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，選取對酵母菌發酵有顯著影響的3個因素，發酵溫度（A）、酵母菌接種量（B）和發酵時間（C）為自變量，以蛋白酶活性為響應值，設計3因素3水平試驗，確定最佳參數進行響應面設計（表1）。

2結果與分析

2.1酵母菌發酵單因素試驗

2.1.1發酵溫度對蛋白酶活性的影響。由圖 1 可知，發酵溫度在20～24 ℃范圍內的時候，蛋白酶的活性隨著溫度的升高而升高，在24 ℃時達到最大值。當溫度超過24 ℃后，蛋白酶的活性明顯降低。所以選擇發酵溫度在24 ℃最適宜。

2.1.2

起始pH對蛋白酶活性的影響。由圖2可知，隨著pH的升高，蛋白酶的活性逐漸升高，當pH超過5.2后，隨著pH的升高，蛋白酶活性逐漸降低?？赡苁怯捎谌芤黑呌谥行裕种屏私湍妇陌l酵作用。起始pH為5.2時，蛋白酶活性達到最大值 2 535.70 U/g，所以確定該酵母的最適起始pH為5.2。

2.1.3

接種量對蛋白酶活性的影響。由圖3可知，酵母菌的接種量在0.20%～0.25%時，蛋白酶的活性迅速升高，在0.25%時達到最高點，蛋白酶的活性為2 582.30 U/g。當接種量超過0.25%后，蛋白酶活性基本保持不變并略有降低。綜合考慮實際生產及經濟等因素，選擇酵母菌的最適宜接種量為0.25%。

2.1.4發酵時間對蛋白酶活性的影響。由圖4可知，蛋白酶的活性隨著發酵時間的延長而增加，但到15 h后，蛋白酶活性增長的速度并不明顯，所以將發酵時間選在15 h比較適宜。

2.2酵母菌發酵工藝條件優化

2.2.1響應面試驗結果。該試驗采用Design-Expert 8.0.5v進行響應面設計，獲得的結果詳見表2，對表2進行回歸分析，得到回歸方程：Y=521.18-34.68A+7.53B- 83.03C+18.83AB+34.72AC+15.81BC-60.48A2-64.39B2-70.90C2。

2.2.2響應面分析與方差分析結果。

圖5、6、7分別表示的是兩兩因素的交互作用對蛋白酶活性的影響。如圖5所示，隨著發酵溫度的升高及酵母菌接種量的增大，蛋白酶活性都是先升高后降低，兩者交互作用使蛋白酶的活性達到最大值為2 485.30 U/g；如圖6所示，發酵溫度與發酵時間兩者交互作用的最大值達2 452.70 U/g；由圖7可知，酵母菌接種量和發酵時間對蛋白酶活性的影響都較大，兩者交互影響蛋白酶活性的最大值達2 558.20 U/g。通過軟件分析，得到菠蘿皮渣酵素發酵的最佳工藝是發酵溫度22.98 ℃，酵母菌接種量0.29%，發酵時間16.39 h，考慮到實際生產的需要及可操作性，修正其工藝條件為發酵溫度為23 ℃，酵母菌接種量為0.3%，發酵時間為16.5 h，重復試驗3次，得到蛋白酶活性分別為2 549.70、2 543.60和2 547.10 U/g，其平均值為2 546.80 U/g，與模型的預測值2 559.60 U/g較為接近，說明該模型對菠蘿皮渣酵素制備的預測具有實際意義。

2.3真空冷凍干燥制備菠蘿皮渣酵素產品質量指標

試驗制得的產品質量各指標如下：①色澤：顏色均一的淡黃色。

②氣味：菠蘿特有的酸甜果香味及發酵香味。③酸度：酸甜適口。④組織形態：松散無結塊。

3結論

該試驗選用菠蘿加工后的廢棄皮渣為原料，利用乳酸菌進行發酵制備酵素，在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken響應面設計進行試驗并分析數據，再結合實際操作情況，獲得制備菠蘿皮渣酵素的工藝條件為發酵溫度23 ℃，酵母菌接種量0.3%，發酵時間16.5 h，在此條件下，制得的菠蘿皮渣酵素顏色均勻，酸甜適口并伴有發酵香味，蛋白酶活性為2 546.80 U/g。該試驗結果可以為規模化生產及功能性產品的開發提供理論依據，其理化性質及穩定性有待進一步研究。

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