初始發酵pH對秸稈酒精醪液沼氣發酵及其系統內微生物群落的影響

朱浩然　李珂　張雅潔

摘要[目的]探究初始pH對秸稈酒精醪液厭氧發酵產甲烷的影響。[方法]利用秸稈酒精醪液作為唯一發酵底物，并將初始發酵pH分別設置為4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，8.5，采用序批式厭氧發酵30 d。[結果]在150 mL的發酵體積下最終的甲烷積累量依次為17、24、227、289、246、257、234和143 mL。當初始發酵pH升高時，發酵液中殘留的揮發性脂肪酸（VFA）中的乙酸所占比例逐漸升高，pH為5.0時乙酸占12.8%，pH為8.5時乙酸占43.9%。通過比較初始pH為4.0、6.5和8.5時，VFAs在發酵過程中的動態變化，發現初始pH為6.5時，乙酸的含量在第1.5天達到峰值，為3 753.6 mg/L 占總量71.6%，最終乙酸被減少了72.4%；初始pH為8.5時，乙酸的含量在第10天時增至峰值，為1 322.9 mg/L（53.8%），最終乙酸減少了36.0%。初始pH為4.0時，VFAs的總量和組成都沒有明顯的變化。當初始發酵pH為6.0、6.5、7.0、7.5時，發酵系統內的優勢細菌為梭菌屬（Clostridium），相對豐度為40%～47%；優勢古菌為甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）和甲烷鬃毛菌屬（Methanosaeta），其相對豐度之和為85%～88%。當初始pH為8.5時，系統內的優勢細菌為普雷沃式菌（Prevotella）和互養單胞菌屬（Syntrophomonas），相對豐度分別為36.8%和14.7%；優勢古菌為甲烷桿菌屬（Methanobacterium）和甲烷熱桿菌屬（Methanothermobacter），在其全古菌序列中分別占 62.3%和 11.4%。[結論]當初始發酵pH為6.5時，甲烷的產氣積累量最高；當初始發酵pH為6.0、6.5、7.0、7.5時，為乙酸營養型型甲烷發酵；當初始pH為8.0和8.5時，為氫營養型甲烷發酵。

關鍵詞酒精醪液；初始pH；厭氧發酵；微生物群落

中圖分類號S216.4文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）20-0065-05

Abstract[Objective]Exploring the impact of initial pH on anaerobic fermentative production of methane from waste liquor of alcohol from stalk.[Method]As the waste liquor of alcohol from stalk was the only fermentation substrate， sequencing batch reactor was utilized for 30 days when the initial pH was 4.0，5.0，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5 respectively. [Result] In the fermentation volume of 150 mL， the final methane accumulates to 17，24，227，289，246，257，234 and 143 mL respectively. When the initial pH was rising， the proportion of acetic acid in VFAsvolatile fatty acids remaining fermentation liquor was also increasing. Acetic acid was 12.8% in proportion when pH was 5.0 and acetic acid is 43.9% in proportion when pH was 8.5. Comparing the dynamic changes of VFAs during fermentation when the initial pH was 4.0，6.5 and 8.5， it turned out that the content of acetic acid reaches to the peak3 753.6 mg/L （71.6% of the total amount） 1.5 days later，and the final consumption of acetic acid was 72.4% when the initial pH was 6.5. Moreover， when the initial pH was 8.5， content of acetic acid reaches to the peak1 322.9 mg/L （53.8% of the total amount） 10 days later，and the final consumption of acetic acid was 36%. There was no obvious change of the total amount or composition of VFAs when the initial pH was 4.0. When the initial pH was 6.0，6.5，7.0，7.5， the dominant bacteria was Clostridium in fermentation system， and the relative abundance was 40%-47%；dominant archaeal was Methanosarcina and Methanosaeta， and the relative abundance was 85%-88%.However， the dominant bacteria was Prevotella and Syntrophomonas in fermentation system， and the relative abundance was 36.8% and 14.7% respectively；dominant archaeal was Methanobacterium and Methanothermobacter， and the relative abundance was 62.3% and 11.4% respectively when the initial pH was 8.5. [Conclusion] The gas from methane accumulates to the highest when the initial pH is 6.5；the dominating methanogenic substrates are acetate when the initial pH is 6.0，6.5，7.0 and 7.5；the dominating methanogenic substrates are H2CO2 when the initial pH is 8.0 and 8.5.

Key wordsAlcohol mash；Initial pH；Anaerobic fermentation；Microbial community

自20世紀能源危機爆發以來，生物質可再生能源便得到越來越多的關注。其中利用農作物秸稈發酵生產生物質乙醇技術得到了快速發展[1]。由于秸稈發酵乙醇在環境問題、糧食問題和能源問題上的重要意義，使其在全球得到了廣泛的認可與重視。秸稈發酵乙醇的工藝主要是預處理（氣爆、酶解），酵母發酵，蒸餾提純；生產過程中會產生大量的高濃度有機醪液（化學需氧量高達20 000～60 000 mg/L），并且呈酸性（pH 2～5），有機懸浮物濃度高（懸浮固體高達10 000～40 000 mg/L）[2]。醪液直接排入環境中，不僅會對環境造成嚴重破壞，也不利于資源與能源的高效利用。目前國內外針對酒精醪液已有多種處理方法，例如DDGS法、濃縮燃燒法、濃縮制肥法、稀釋農灌法以及生物處理法等[3]。利用厭氧發酵原理對酒精醪液進行厭氧消化最終產生甲烷，這一技術不僅符合廢水資源化回收利用的清潔生產性質，也會給廠家帶來一定的經濟效益。

厭氧發酵是一種復雜的物理化學與微生物活動過程。厭氧消化過程產生的有機小分子酸主要包括乙酸、丙酸、丁酸、乳酸等。不同的發酵途徑會產生多種特定的末端產物，起作用的微生物的種類不同。王晉[4]在文獻綜述中總結了能夠以揮發性脂肪酸（VFA）為末端代謝產物的3類功能菌群：水解發酵產酸菌、產氫產乙酸菌和同型產乙酸菌。水解發酵產酸細菌可以將底物中復雜有機物（纖維素、蛋白質和脂類等）水解，再經過各自的產酸代謝途徑將水解后的小分子轉化為乙酸、丙酸等VFA。完成水解作用的細菌主要是嚴格厭氧的擬桿菌、梭菌及兼性厭氧的真桿菌等，而產酸發酵細菌則是產酸效率較高的產芽孢細菌，如梭菌科、鏈球菌科、芽孢乳桿菌科、毛螺菌科等。產甲烷菌是一類以甲烷為最終產物的微生物，該過程也是厭氧消化產甲烷的最終過程，因此被認為是直接影響甲烷產量的微生物。產甲烷菌一詞是在 1974年由 Bryant 首次提出的，將產甲烷菌同嗜甲烷菌區別開。所有的產甲烷菌都有3個共同特征：①都能夠產甲烷，并通過產甲烷獲得生長所需要的大部分能量。②都屬于古菌域中的廣古菌門。③都是嚴格的厭氧菌。根據厭氧發酵產甲烷的原理，產甲烷菌和與之相關的功能性微生物在發酵過程中起到了重要作用[5]。而影響微生物生長的因素有很多，其中pH是一個重要因素[6]。相關文獻表明，厭氧發酵的適合pH應該在6.0～8.3[7]；6.5～7.5時產氣最好[8]；pH在6.8～7.2時啟動速度最快[9]。目前針對酒精醪液厭氧發酵產甲烷的研究大多集中于木薯、玉米等淀粉類物質產酒精后的醪液，而以純纖維素類物質如玉米秸稈或稻草等發酵后醪液的厭氧發酵研究還很少見。因此，筆者選用秸稈酒精醪液作為生物厭氧發酵產甲烷的底物，以39 ℃發酵，研究不同初始pH對厭氧發酵的積累甲烷產量、發酵產物VFAs的分布的影響，分析并探討初始pH對秸稈酒精醪液厭氧發酵產甲烷及反應體系中微生物生長的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1酒精醪液。

該試驗中的酒精醪液取自吉林長春某秸稈酒精發酵廠的廢水厭氧發酵系統中反應器的中部，取樣時系統運轉良好。醪液水質呈酸性，總化學需氧量（TCOD）和總懸浮固體物質濃度（TS）較高，分別為7.4×104和6.1×104 mg/L。同時具有較高的可生化性，五日生化需氧量（BOD5）為1.5×104 mg/L，其他如溶解性化學需氧量（SCOD）、總氮（TN）、總磷（TP）、氨氮（NH+4-N）檢測結果詳見表1。為保證醪液水質的穩定性，將醪液儲存于4 ℃的冰箱中備用。

1.1.2接種污泥。

接種污泥分別取自原發酵廠的厭氧污泥床（UASB）反應器中的厭氧顆粒污泥。為保持污泥活性，將其保存于4 ℃冰箱內。接種前6 h將污泥置于35 ℃搖床，振蕩培養12 h使其恢復活性[9]。

1.2方法

所有的發酵試驗均在自制的250 mL厭氧反應器（圖1）中進行，向其中添加135 mL酒精醪液，15 mL活性污泥，并且使用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl將混合液的pH調節為為4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5。利用厭氧反應器上通入發酵液中的橡膠管向其中通入99.99%的氮氣，10 min。之后，確保關閉反應器上所有的三通閥，用凡士林密封瓶蓋，放入恒溫培養箱內（上海一恒 MGC-450BP-2）培養，設置培養溫度為（39±1）℃，振蕩速率為150 r/min，厭氧發酵的周期為30 d。

1.3分析方法

該試驗中的TCOD、SCOD、TN、TP、NH+4-N、TS及VS等常規指標均采用國標法測定。醪液、接種物和發酵液的pH通過pH計（梅特勒-托利多）測定。氣體組分使用氣相色譜儀（北京京科瑞達）測定，熱導檢測器（TCD），色譜柱為PropoR-Q（2 m×3 m）柱，載氣采用氦氣，其流速為25 mL/min，氣體進樣量為1 mL，定量方法為外標法。VFA（乙酸、丙酸、正丁酸之和）通過高效液相色譜儀（日本島津）測定，緩沖液為0.1%的磷酸緩沖液；色譜柱為C18反相柱；檢測器為紫外可見光檢測器，進樣量為20 μL，流速為1.0 mL/min。底泥總DNA的提取采用試劑盒（Fast DNA SPIN kit for soil），提取過程按試劑盒說明書進行。測序平臺為MiSeq測序平臺（上海美吉），PCR擴增引物對于細菌是338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG3′）和806R（5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT3′）；對于古菌是519F（5′CAGCMGCCGCGGTAA3′）和915R（5′GTGCTCCCCCGCCAATTCCT3′）。PCR采用Trans Gen AP22102：Trans Start Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反應體系。細菌PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；然后95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27個循環。古菌PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；然后95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，32個循環。

高通量測序所得的序列通過 QIIME（http：//qiime.org/tutorials/index.html）和RDP Classifier[10]（version 2.2 http：//sourceforge.net/projects/rdpclassifier/，置信度閾值為0.7）進行處理，比對數據庫為Silva[11]（Release119 http：//www.arbsilva.de）。

2結果與分析

2.1不同初始發酵pH條件下各反應器的甲烷發酵規律

在控制除pH以外的所有條件下，經30 d的序批式厭氧發酵，8組反應器內的發酵系統基本處于穩定。根據圖2，所有反應器在150 mL的發酵體積下最終甲烷積累量由高至低依次是pH 6.5（289 mL）、pH 7.5（257 mL）、pH 7.0（246 mL）、pH 8.0（234 mL）、pH 6.0（ 227 mL）、pH 8.5（143 mL）、pH 5.0（24 mL）、pH 4.0（17 mL）。在發酵后12 h就已啟動的反應器共有5組，分別是pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5和pH 8.0，產氣量依次是28、53、46、44、8 mL。pH 4.0和pH 5.0在發酵開始后，基本沒有太明顯的發酵活動，產氣也極其微弱。而pH 8.5在發酵開始后第4天才有明顯的產氣活動。根據圖3，pH 8.5發酵第1天到第4天的日產氣量分別是4.0、9.0、1.5、11.5 mL，而發酵啟動最快的pH 6.5發酵開始4 d內的日產氣量分別為88.0、78.0、7.5、6.5 mL。pH 6.0、pH 7.0、pH 7.5的產氣規律較為相似。同時分析發現，所有反應器在發酵開始20 d后，日產氣量均低于5 mL。綜上，當pH接近于中性時有利于厭氧發酵的啟動；pH偏堿性時厭氧發酵會滯后，pH過低時厭氧發酵不能正常啟動。

2.2不同初始發酵pH條件下各反應器內發酵過程中VFA含量的變化

根據圖4可知，當初始發酵pH不同時，各反應器內的VFA積累曲線具有一定的差異性。當初始pH為4.0和5.0時，系統內的VFA含量變化不明顯。當初始pH為6.5時，系統內的VFA含量以最快的速度達到所有反應器內的峰值，即發酵開始后1.5 d達到4 386 mg/L。當初始pH低于或者高于6.5時，其系統內的VFA含量出現的峰值都要小于反應器pH 6.5內的峰值，各反應器內VFA的含量最高時為pH 6.0（4 058 mg/L）、pH 7.0（4 041 mg/L）、pH 7.5（3 998 mg/L）、pH 8.0（3 259 mg/L）、pH 8.5（2 459 mg/L）、pH 5.0（1 299 mg/L）、pH 4.0（1 178 mg/L）。其中當初始pH為8.5時，反應器在發酵開始后的第10天才達到VFA含量的峰值，同甲烷產氣的積累曲線一樣出現了滯后現象。以上說明甲烷發酵的啟動速度與VFA的積累速度有直接關系。所有反應器發酵結束后，最終的VFA含量由高至低依次為pH 8.5（1 936 mg/L）、pH 7.0（1 659 mg/L）、pH 6.5（1 630 mg/L）、pH 6.0（1 516 mg/L）、pH 8.0（1 425 mg/L）、pH 7.5（1 382 mg/L）、pH 5.0（1 257 mg/L）和pH 4.0（1 146 mg/L）。

2.3初始pH為4.0、6.5和8.5時系統內VFA組成的動態變化

圖5為初始pH 4.0、6.5、8.5時，發酵開始1.5、4.0、10.0、18.0和30.0 d時發酵系統內VFA的組成情況。在發酵開始初期，3組反應器內的VFA組成情況為乙酸11.7%（97.30 mg/L）、丙酸36.3%（302.00 mg/L）、丁酸52.0%（432.64 mg/L）。當初始pH為4.0時，發酵過程中主要變化的成分是丙酸和丁酸，乙酸的含量從發酵開始后緩慢增長，最終為198.3 mg/L（17.3%），丙酸和丁酸最終的含量分別為58.4 mg/L（5.1%）和889.3 mg/L（77.6%），這說明系統內的乙酸菌被嚴重抑制，丁酸菌成為了優勢菌。在初始pH為6.5的反應器內，乙酸含量變化起伏較大，在發酵開始后1.5 d，乙酸的含量由97.3 mg/L（11.7%）激增至3 753.6 mg/L（71.6%），之后乙酸的含量又持續較低，最終為386.3 mg/L（2.4%），而丙酸和丁酸最終的含量分別為133.6 mg/L（8.2%）和1 110.0 mg/L（6.8%）。這可能是因為在反應器pH 6.5內，乙酸菌在發酵前期大量繁殖，所以乙酸的含量迅速升高，隨著發酵的持續發酵基質減少以及乙酸型產甲烷菌的存在，乙酸的含量又迅速減少。當發酵pH為8.5時，系統內丙酸和丁酸含量的變化與pH為6.5時相似，最終的含量分別為311.7 mg/L（1.6%）和774.4 mg/L（40.0%）。乙酸的含量自發酵開始后變化緩慢，但發酵時間持續到第10天時乙酸的含量增至1 322.9 mg/L（53.8%），最終消耗至849.9 mg/L（43.9%），相較于反應器pH 6.5，反應器pH 8.5內最終的乙酸含量比峰值減少了36.0%，而pH 6.5內卻減少了72.4%。以上說明當初始發酵pH為8.5時，系統的產乙酸菌生長緩慢，且系統內沒有優勢的乙酸型產甲烷菌，從而造成了pH 8.5內乙酸的堆積。

2.4發酵系統內中的微生物群落

在歷經30 d的厭氧發酵后，8組不同初始發酵pH的發酵系統已基本停止產生甲烷。提取發酵液中的DNA，通過Miseq高通量測序分析其中的細菌和古菌菌落的結構特征。測序共得到有效的細菌序列157 107條以及有效的古菌序列87 228條，所有反應器內的細菌覆蓋度超過99%，所有反應器內古菌的覆蓋度超過了99.9%，所以此次測序所得的序列深度能夠充分代表各反應器內的細菌和古菌種類。

2.4.1不同初始發酵pH反應器內細菌菌落的結構。

所得全部序列在經過一系列的質量控制后，按照97%相似性進行OTU的聚類，并且合并相對豐度低于1%的細菌菌屬之后，得圖6。如圖6所示，不同初始發酵pH的反應器內細菌菌落在屬水平上結構差異性較為明顯。明顯地，反應器pH 4.0和pH 5.0的細菌菌屬結構相似，它們的優勢菌屬為擬桿菌門的擬桿菌屬，其相對豐度分別是35.7%和37.3%。而梭菌屬在反應器pH 6.0、6.5、7.0和7.5中有著絕對的優勢，其相對豐度依次為40.5%、46.7%、42.3%和40.4%，梭菌屬是一類同型產乙酸菌，因此還可能利用 H2 和 CO2 產生乙酸，供乙酸利用型的產甲烷菌如甲烷鬃毛菌屬或甲烷八疊球菌作為底物產甲烷[12]。同時隸屬于厚壁菌門的毛螺旋菌屬和屬于互養菌門的互養單胞菌屬也有較高的分布，其在全菌序列中所占比例分別為13%～22%和8%～15%。當初始發酵pH變為8.0和8.5時，發酵系統內的細菌菌落分布又有了較大的變化，具體表現為，原本在中性或者酸性的初始發酵環境中的優勢菌梭菌屬的相對豐度大幅減少，其在pH 8.0和8.5中的相對豐度分別為12.8%和8.9%，優勢菌變化為普雷沃式菌和互養單胞菌屬，它們能與氫營養型的產甲烷菌，例如甲烷桿菌屬，合作共生將長鏈脂肪酸降解轉化乙酸和氫[13]。它們的相對豐度分別為25.3%、36.8%和13.9%、14.7%。同時發現，隸屬于螺旋體門的密螺旋菌屬在初始發酵pH接近中性時有著較為豐富的含量，其在pH 6.0、6.5、7.0和7.5中的相對豐度依次為7.3%、5.9%、7.8%和3.2%，而在其他反應器內的含量均小于2%，并且該菌同樣是一類同型產乙酸菌。并且在各反應器內還發現了硝化螺旋菌屬、共養桿菌屬、脫硫弧菌屬、綠灣菌屬和一些含量較少的菌屬。以上結果說明，當初始pH接近中性時有利于產乙酸菌得生長，當初始pH偏堿性時則會抑制產乙酸菌從而造成產氫菌的大量繁殖。

2.4.2不同初始發酵pH反應器內古菌菌落的結構.

在全部的反應器中，廣古菌門是絕對的優勢菌，其在反應器pH 4.0中的相對豐度依次為94.3%、94.7%、96.8%、97.4%、98.2%、97.3%、96.9%和98.3%，并且還有少部分的古菌屬于奇古菌門和泉古菌門。對所有反應器中的全古菌庫在屬的水平上進行分析，根據圖7，各反應器的古菌菌落差異較為明顯，其中pH 4.0和5.0的古菌菌落結構較為相似，且優勢菌的分布也較為均勻，具體的優勢菌為甲烷桿菌屬、甲烷八疊球菌屬以及甲烷熱桿菌屬，該3類產甲烷菌在pH 4.0中的相對豐度依次為33.8%、19.7%和23.5%，在pH 5.0中的相對豐度依次為29.1%、19.3%和26.4%。而反應器pH 6.0、6.5、7.0、7.5的古菌菌落的結構相似度較高，該4組反應器的優勢菌均為隸屬于甲烷八疊球菌目的甲烷鬃毛菌屬和甲烷八疊球菌屬，這是2類乙酸營養型產甲烷菌。兩者所占全古菌菌庫之和依次為85.1%、87.9%、85.4%以及86.8%。其中pH 6.5的甲烷八疊球菌屬含量最高，為50.8%；pH 6.0的甲烷鬃毛菌屬含量最高為46.3%。同樣地，甲烷八疊球菌屬和甲烷鬃毛菌屬在pH 8.5中的相對豐度僅為9.4%與9.9%，其發酵系統內的優勢古菌為隸屬于甲烷桿菌目的甲烷桿菌屬和甲烷熱桿菌屬，其在反應器pH 8.5中的全古菌序列中分別占62.3%和11.4%，而甲烷桿菌屬和甲烷熱桿菌屬是2類氫營養型的產甲烷菌。造成上述現象的原因可能是，當初始發酵pH接近中性時，系統內存在大量產乙酸細菌，如梭菌屬、密螺旋菌屬，促進了乙酸型產甲烷菌的生長如甲烷鬃毛菌屬和甲烷八疊球菌屬。相反地，當初始pH偏堿性時，系統內產乙酸菌的生長會受到抑制產氫細菌大量繁殖，從而促使了氫營養型產甲烷菌的繁殖。而一個良好的沼氣反應器中產甲烷的主要途徑應該是乙酸型的產甲烷途徑[14-15]，所以這可能就是反應器pH 8.5產氣不良的主要原因。

3結論與展望

當初始發酵pH為6.5時，甲烷的產氣最高。過低的pH會抑制參與水解了大分子有機物的微生物和產甲烷

菌的生長，造成發酵系統不能正常啟動；過高的pH則會阻礙產乙酸

菌的生長，從而導致產氫菌的繁殖，最終導致氫營養型的

甲

烷菌成為優勢菌，從而造成不良產氣效果。該研究還缺乏對

整個發酵階段的微生物動態變化進行系統性的研究，結論的數據支持還不夠完整，最后希望能夠通過該研究給酒精醪液發酵產業及研究帶來一定的技術支持。

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