絲瓜絡(luò)填料反硝化濾池中微生物群落結(jié)構(gòu)研究

張瀏　欒曉男　杜玉來(lái)

摘要[目的]檢測(cè)絲瓜絡(luò)反硝化濾池內(nèi)主要微生物菌群，優(yōu)化濾池運(yùn)行參數(shù)。[方法]綜合使用PCR-DGGE、高通量測(cè)序等微生物分析手段，研究了該濾池內(nèi)生物群落結(jié)構(gòu)。[結(jié)果]填料表面微生物多樣性豐富，優(yōu)勢(shì)菌屬為紅假單胞菌屬、綠棒菌屬、紅芽生菌屬、芽生綠菌屬、氣單胞菌屬。[結(jié)論]該研究結(jié)果對(duì)于提高反硝化濾池處理污染物的效率具有指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞絲瓜絡(luò)填料；微生物分析；反硝化生物濾池

中圖分類(lèi)號(hào)X52文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）20-0060-05

Abstract[Objective] To test the main microbial flora in the loofah denitrification biofilter and optimize the operation parameters.[Method] The community structure of the filter was studied by means of PCRDGGE，high throughput sequencing and other microbiological analysis methods.[Result] The microbial diversity on the surface of the stuffing is abundant.The dominant species were Rhodopseudomonas，Chlorobaculum，Rhodoblastus，Blastochloris，Eromonas. [Conclusion]The research results have guiding significance for improving the efficiency of denitrifying filter treatment pollutants.

Key wordsLoofah filler；Microbiological analysis；Denitrification filter

目前，我國(guó)污水處理廠(chǎng)普遍采用的污水處理工藝有A/O、氧化溝和SBR 等，由于受原污水 COD/N 較低的限制，加之長(zhǎng)期以來(lái)我國(guó)污水處理廠(chǎng)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)中僅規(guī)定了氨氮（NH4+-N）和總氮（TN）的最高允許排放濃度，且 TN 最高允許排放濃度比NH4+-N至少高 10 mg/L，這些因素導(dǎo)致污水處理廠(chǎng)出水中 TN 至少有 60%為硝酸鹽氮，部分污水處理廠(chǎng)出水硝酸鹽最高可達(dá)20 mg/L[1]，并已造成地表及地下水體不同程度的硝酸鹽污染[2-3]。水體中過(guò)高的硝酸鹽濃度直接影響供水水質(zhì)安全，對(duì)嬰幼兒具有毒害作用，在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為致癌物質(zhì)[4]；另一方面，可導(dǎo)致溫室性氣體N2O的產(chǎn)生[5-6]。因此，降低硝酸鹽濃度已經(jīng)成為水處理研究中的重要課題[7-13]。

常規(guī)去除硝酸鹽的辦法有離子交換、反滲透和生物法[14]，但離子交換和反滲透由于價(jià)格昂貴，處理費(fèi)用較高，去除效果有限，而難以達(dá)到推廣應(yīng)用[15-19]。而生物法中反硝化生物濾池是解決該類(lèi)問(wèn)題經(jīng)濟(jì)有效的方法之一。其中反硝化是將硝酸鹽或者亞硝酸鹽氮轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)氮的生物過(guò)程[20-21]，而反硝化生物濾池中起關(guān)鍵作用的就是生長(zhǎng)在載體填料上的微生物。筆者研究了以絲瓜絡(luò)為填料的生物濾池，分析其微生物特征，以期找到更優(yōu)異的填料，旨在為以絲瓜絡(luò)為填料的生物濾池處理生活污水提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)采用的反應(yīng)器由有機(jī)玻璃圓柱制成，高420 cm，內(nèi)徑12 cm，有效體積47 L（圖1）。球形絲瓜絡(luò)填料直徑為8 cm，每個(gè)球形填料中絲瓜絡(luò)重量為5 g左右。采用間歇運(yùn)行的方式，進(jìn)水時(shí)間為6 min，流量為0.47 m3/h。

1.2試驗(yàn)材料

試驗(yàn)采用運(yùn)行穩(wěn)定、且控制在最優(yōu)脫氮條件下的絲瓜絡(luò)填料為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行微生物分析。

1.3分析方法

1.3.1Miseq高通量測(cè)序生物信息學(xué)分析。

首先提取樣品基因組DNA，設(shè)計(jì)并合成引物接頭，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化，待純化完成后，進(jìn)行PCR產(chǎn)物定量和均一化，最后進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序完成后對(duì)序列進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及生物信息學(xué)分析。

1.3.2PCR-DGGE技術(shù)原理及環(huán)境微生物群落多樣性分析。

DGGE是通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠中變性劑濃度梯度的不同，將序列不同的DNA分開(kāi)。根據(jù)變性劑梯度方向的不同，DGGE可分為：垂直DGGE，即變性劑梯度與電場(chǎng)方向垂直，常用于試驗(yàn)決定分離型、野生型和變異型的最佳變性劑梯度范圍；平行DGGE，其變性劑的梯度和電場(chǎng)方向平行，主要用于解鏈范圍明確的DNA片段檢測(cè)。該試驗(yàn)流程如圖2所示。

2結(jié)果與分析

2.1PCR-DGGE測(cè)序結(jié)果

2.1.1DGGE凝膠電泳圖。試驗(yàn)共取3個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品取2組平行（樣品1平行樣記為1-1和1-2，樣品2平行樣記為2-1和2-2，樣品3平行樣記為3-1和3-2）。采用Biolinker DNA Red染液對(duì)DGGE膠圖進(jìn)行泡染，染色完成后的膠圖在Bio-Rad凝膠成像儀上進(jìn)行拍照，結(jié)果見(jiàn)圖3。

通過(guò)Quantity-One軟件分析原DGGE膠圖，將膠圖轉(zhuǎn)換成直觀的條帶分布圖（圖4），位于同一水平線(xiàn)的為相同物種，該圖左右兩側(cè)的數(shù)字為經(jīng)分析后該板膠共有的條帶數(shù)（也可認(rèn)為是該板膠上所有樣本包含的物種數(shù)）。最下面一行表示以第1個(gè)樣本為基準(zhǔn)的前提下，其余樣本與第1個(gè)樣本的相似性。

圖4下方的百分?jǐn)?shù)中1對(duì)應(yīng)的100%表示以樣品1-1為基準(zhǔn)，在該條件下，其余樣本與該樣本的相似性。可以看出，1-1與1-2、2-1與1-2、3-1與3-2非常相似，說(shuō)明取樣情況較好，能夠反映各樣品的真實(shí)情況。同時(shí)可知，樣品1與樣品2的相似性在85%左右，與樣品3的相似性?xún)H在70%，說(shuō)明樣品1和樣品2群落結(jié)構(gòu)更相似。

2.1.2生物群落多樣性指數(shù)。

由表1可知，樣品1的群落多樣性最高，樣品2最小。

2.1.3非加權(quán)組平均法（UPGMA）進(jìn)行樣品間的聚類(lèi)分析。UPGMA

是一種較常用的聚類(lèi)分析方法。通過(guò)Quantity One軟件的UPGMA法所產(chǎn)生的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)可以直觀地看到各樣品之間的相似性。由圖5可知，對(duì)于3個(gè)樣品所取的平行組，相似系數(shù)均在95%以上，說(shuō)明這3個(gè)樣品取樣均一，能夠代表樣品的真實(shí)情況，并且從圖5中也可以看出樣品1和樣品2的相似性更高。

2.1.4克隆測(cè)序匯總。PCR-DGGE的膠條切下共16條（編號(hào)1～6）進(jìn)行回收，擴(kuò)增區(qū)域：16S，克隆測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，菌種Chlorobium limicola strain DSM 245，Rhodopseudomonas palustris TIE-1 strain TIE-1，Chlorobaculum limnaeum strain DSM 1677，Magnetospirillum bellicus strain VDY，Rhodoblastus acidophilus strain DSM 137，Clostridium saccharobutylicum strain NCP 262的相似性均為100%，說(shuō)明這些菌種是3個(gè)樣品共有的菌種，而其中Chlorobaculum limnaeum strain DSM 1677菌屬相似度為100%，條帶占比100%，說(shuō)明該菌種是3個(gè)樣品的優(yōu)勢(shì)菌種。Chondromyces Robustus strain Cm a13，Chloroba culum parvum NCIB 8327，Rhodopseudomonas palustris TIE-1 strain TIE-1，Thiomonas perometabolis strain ATCC 23370、Dyella thiooxydans strain ATSB10菌種的數(shù)目也較多，且在3個(gè)樣品中也基本都有。

2.2高通量測(cè)序結(jié)果

通過(guò)PCR-DGGE分析結(jié)果可知，6個(gè)樣品均具有較好的代表性。同時(shí)也為了節(jié)約測(cè)序成本，采用編號(hào)1-1樣品代表樣品1，編號(hào)2-1代表樣品2，3-1代表樣品3來(lái)開(kāi)展高通量測(cè)序工作。

2.2.1指數(shù)分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)。由在指定的相似水平為97%（0.03）的條件下，樣品的各多樣性指數(shù)見(jiàn)表3。由表3可知，樣品2-1的OTU序列數(shù)最高，1-3最低，而3個(gè)樣品中1-1的優(yōu)化序列劃分得到的OTU數(shù)目最多，為1 566。由此可知，1-1和3-1樣品的物種總數(shù)較多，樣品3-1的香農(nóng)指數(shù)最高，為3.48。各樣品文庫(kù)的覆蓋率均在98%以上，樣本中序列沒(méi)有被測(cè)出的概率較低，覆蓋較深，可見(jiàn)該次測(cè)序結(jié)果能夠充分代表樣本的真實(shí)情況。

2.2.2稀釋性曲線(xiàn)。圖6是在97%相似水平下劃分OUT并繪制出的各樣品稀釋曲線(xiàn)。知以看出，3個(gè)樣品的曲線(xiàn)趨向平坦，說(shuō)明這3個(gè)樣品的取樣數(shù)量合理，取樣深度足夠，能夠代表樣品的真實(shí)情況。

2.2.3各樣本間在門(mén)分類(lèi)水平的比較。

在門(mén)分類(lèi)水平上，根據(jù)各樣品中微生物組成繪制柱狀圖，比較各樣本在門(mén)分類(lèi)水平上群落結(jié)構(gòu)組成的差異，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，1-1、1-2樣品在門(mén)水平上群落結(jié)構(gòu)比較相似，與1-3樣品中群落結(jié)構(gòu)略有差距，這與DGGE測(cè)序得出的結(jié)果一致。主要體現(xiàn)在1-1、1-2樣品群落結(jié)構(gòu)中，綠菌門(mén)（Chlorobi）數(shù)目占的比例最大，變形菌門(mén)（Proteobacteria）次之，而1-3樣品中變形菌門(mén)最多，其次是綠菌門(mén)。在擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）等菌門(mén)上，差距不明顯。

2.2.4熱圖（Heatmap）。

Heatmap 可以用顏色變化來(lái)反映二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)信息，它可以直觀地將數(shù)據(jù)值的大小以定義的顏色深淺表示出來(lái)。常根據(jù)需要將數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)，將聚類(lèi)后的數(shù)據(jù)表示在heatmap圖上，通過(guò)顏色的梯度及相似程度來(lái)反映數(shù)據(jù)的相似性和差異性。

圖8是根據(jù)屬水平上OTU中所含序列的數(shù)量位于前50的信息進(jìn)行繪制，分別按照樣品和分類(lèi)進(jìn)行聚類(lèi)后做出Heatmap圖，能夠反映出樣品在屬水平上表現(xiàn)的相似性或者差異性。

由圖8可知，3個(gè)樣品的菌落結(jié)構(gòu)在菌屬水平上非常相似，紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）、綠棒菌屬（Chlorobaculum）、紅芽生菌屬（Rhodoblastus）、芽生綠菌屬（Blastochloris）、氣單胞菌屬（Aeromonas）是這3個(gè)樣品共同的優(yōu)勢(shì)菌屬，其中綠棒菌屬在所有的菌屬中豐度最大，而此菌屬一般為光能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型，專(zhuān)性厭氧，在無(wú)氧、有光照的水體中生長(zhǎng)。說(shuō)明試驗(yàn)裝置中溶解氧濃度非常低，厭氧環(huán)境好。同時(shí)反應(yīng)裝置由有機(jī)玻璃制成，透明，光照條件好，有利于這些菌屬的生長(zhǎng)。

3結(jié)論

（1）該研究結(jié)果表明，DGGE測(cè)序與高通量測(cè)序結(jié)論基本一致。而DGGE測(cè)序只能檢測(cè)到主要的微生物，如果總量占1%以下，便不能被檢測(cè)到，高通量測(cè)序樣品檢測(cè)到26門(mén)35綱55目85科153屬，說(shuō)明DGGE顯著低估了微生物的群落組成。通過(guò)對(duì)比這兩種測(cè)序方法可知，高通量測(cè)序的檢測(cè)靈敏度是DGGE的4～39倍，若進(jìn)一步分析樣品主要微生物類(lèi)群的相對(duì)豐度，發(fā)現(xiàn)分類(lèi)水平越低，高通量測(cè)序與DGGE的結(jié)果差異越大，尤其在科和屬的水平上差異最大[22]。并且高通量測(cè)序能夠較為全面和準(zhǔn)確的反映微生物群落結(jié)構(gòu)，而DGGE僅能夠反映有限的優(yōu)勢(shì)微生物類(lèi)群，在很大程度上極可能低估微生物的物種組成并高估其豐度。

（2）以絲瓜絡(luò)作為反硝化濾池的填料，通過(guò)高通量測(cè)序以及基于PCR-DGGE技術(shù)的環(huán)境微生物群落多樣性分析，初步得出：優(yōu)勢(shì)菌屬為紅假單胞菌屬、綠棒菌屬、紅芽生菌屬、芽生綠菌屬、氣單胞菌屬。

絲瓜絡(luò)作為反硝化濾池填料時(shí)，微生物生長(zhǎng)狀況良好，表面微生物比較豐富，初步認(rèn)為絲瓜絡(luò)可以作為反硝化生物濾池的填料。

參考文獻(xiàn)

[1]

李魁曉，白雪，李鑫瑋，等.城市污水廠(chǎng)二級(jí)處理出水深度處理組合工藝研究[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2012，6（1）：63-67.

[2] 劉相超，周政輝，宋獻(xiàn)方，等.梁灘河地表水與地下水水化學(xué)及硝酸鹽污染[J].重慶交通大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，28（5）： 942-947.

[3] KIM R H，LEE J，CHANG H W.Characteristics of organic matter as indicators of pollution from smallscale livestock and nitrate contamination of shallow groundwater in an agricultural area[J].Hydrological processes，2003，17（12）：2485-2496.