安徽鳳陽玉米穗腐病病原菌的分離鑒定

許大鳳 張海珊 李廷春

摘要 [目的]明確鳳陽玉米穗腐病的病原菌種類。[方法]在鳳陽玉米種植區采集玉米穗腐病樣品，采用組織分離法對病樣進行分離與純化，結合病原菌形態學特征與分子生物學進行鑒定。[結果]分離得到的56株病原菌分別為禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）、尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、串珠鐮孢菌（Fusarium verticillioides）、多變根毛霉（Rhizomucor variabilis）和青霉菌（Penicillium spp.），其分離頻率分別為44.64%、21.42%、14.29%、14.29%和5.36%。禾谷鐮孢菌Fg21菌絲生長溫度為5～30 ℃，最適生長溫度為25 ℃，最適pH為7.0；尖孢鐮孢菌Fa09菌絲生長溫度為10～35 ℃，最適生長溫度為28 ℃，最適pH為7.0；串珠鐮孢菌Fv03菌絲生長溫度為10～35 ℃，最適生長溫度為25 ℃，最適pH為10.0；碳源對鐮孢菌菌株營養生長影響相對穩定，而氮源對其營養生長影響的變幅較大。[結論]試驗結果為玉米穗腐病的綜合防治提供了理論依據。

關鍵詞 玉米穗腐病；病原鑒定；生物學特性

中圖分類號 S435.131 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）25-0145-04

Abstract [Objective] The aim was to know the pathogens causing maize ear rot in Fengyang.[Method] The maize ear rot samples were collected from Fengyang County.The tissue isolation method was adopted to isolate the maize disease samples，and then purified them.The pathogens were identified based on results of morphological characteristics and molecular biology.[Result] Fiftysix isolates were identified as members of Fusarium gra minearum，Fusarium oxysporum，Fusarium verticillioide，Rhizomucor variabilis and Penicillium spp.，and the isolation frequency were 44.64%，21.42%，14.29%，14.29% and 5.36%，respectively.In this experiment，Fusarium gra minearum was the predo minant species in maize ear rot.The Fusarium gra minearum Fg21 could grow under 5-30 ℃，with optimal condition at 25 ℃，pH 7.0；the Fusarium oxysporum Fa09 could grow unde 10-35 ℃，with optimal condition at 28 ℃，pH 7.0；the Fusarium verticillioide Fv03 could grow unde 10-35 ℃，with optimal condition at 25 ℃，pH 10.0.Vegetative growth of Fg21，Fa09 and Fv03 were found to be significantly influenced by nitrogen source compared with carbon source.[Conclusion] The results provide theoretical basis for comprehensive prevention and control of maize ear rot.

Key words Maize ear rot；Isolation of pathogenic bacteria；Biological characteristics

玉米穗腐病是一種世界性的玉米病害，不僅造成產量損失嚴重，而且嚴重影響玉米的品質[1]。侵染玉米穗腐病病原菌種類較多，達30余種[2]，鐮孢菌約有15種[3-4]。國外報道常見鐮孢菌主要有膠孢鐮孢、輪枝鐮孢（F.verticilliods）、禾谷鐮孢（F.graminearum）、層出鐮孢（F.proliferatum）、木賊鐮孢菌（F.equiseti）等[5-8]，而國內報道有串珠鐮孢菌（F.moniliforme）、禾谷鐮孢菌、黃色鐮孢菌、尖鐮孢菌（F.oxysporum）、木賊鐮孢菌、亞粘團鐮孢菌和層出鐮孢菌等[9]。由于該病是由幾種甚至十幾種病原菌復合侵染引起的，因而較難防治；同時穗腐病發病期在穗期，則更加大了防治難度；抗病品種是防治玉米穗腐病最有效的措施。因此，鑒定出病原菌并測出優勢病原菌，是進行品種資源抗病性鑒定的首要問題。

筆者對安徽鳳陽玉米穗腐病進行調查和取樣，采用形態學觀察和分子生物學鑒定的方法對玉米穗腐病病樣品進行了分離鑒定，并對其進行了生物學特性研究，旨在為玉米穗腐病的綜合防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

根據田間自然發病植株，于2015年7月至2016年9月從安徽省鳳陽縣共采集病穗26份，將其分別裝入信封袋中，標記，帶回實驗室。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離。選取病穗病健交界處3～5粒玉米粒，2%次氯酸鈉表面消毒5 min，無菌水洗滌3次后放入PDA平板培養基上，28 ℃下培養4 d，選取不同菌落進行形態學鑒定純化培養。

1.2.2 病原菌的鑒定。

1.2.2.1 形態學鑒定。

參照《真菌鑒定手冊》[10]《常見鐮刀菌鑒定指南》[11]和《植病研究方法》[12]對分離的病原菌進行形態學鑒定。通過觀察菌株的形態特征及培養性狀進行病原菌的鑒定。將分離的菌株在PDA培養基上進行培養，觀察菌落形態及顏色等性狀。采用SNA培養基對分離菌株進行培養，對病原菌進行觀察[11，13-14]。

1.2.2.2 分子生物學鑒定[15-16]。

將分離純化的分離物接種于表面貼有滅菌玻璃紙的PDA平板上，28 ℃培養5 d，挑取菌絲，加入30 μL 0.5 mol/L NaOH，用滅菌的研磨棒充分研磨，然后加水至1 500 μL（含量少的加水至1 000 μL），搖勻，12 000 r/min離心5 min，取上清做模板。

選用真菌rDNA-ITS區域通用引物ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），進行PCR擴增。PCR反應體系： Pre.mix.Taq 25 μL，引物ITS1和ITS4各1 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O 補足至50 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往上海英濰捷基公司測序，將測序結果在GenBank 數據庫中進行比對。

1.2.3 生物特性的研究。

1.2.3.1 溫度對病原菌營養生長的影響。

將病原菌菌株在PDA平板上28 ℃下培養3 d，用滅菌的內徑為6 mm的打孔器切取菌落邊緣菌餅，移至PDA平板上中央，分別于5、10、15、20、28、25、30和35 ℃共8個溫度下黑暗培養3 d，每處理3個重復。3 d后用十字交叉法測量菌落生長直徑。

1.2.3.2 pH對病原菌營養生長的影響。

用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl將滅過菌的PDA培養基調節pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0共8個梯度。移植6 mm的菌餅于PDA平板的中央，28 ℃下黑暗培養3 d，每個處理3個重復。3 d后用十字交叉法測量菌落生長直徑。

1.2.3.3 病原菌對碳、氮的利用。

將病原菌菌株在PDA平板上28 ℃下培養3 d，用滅菌的內徑為6 mm的打孔器切取菌落邊緣菌餅，分別移至葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、甘露醇和可溶性淀粉做成的不同碳源固體培養基中央；DL-天門冬酰胺、牛肉膏、酵母膏、硝酸鉀、硫酸銨、蛋白胨和尿素做成的不同氮源的固體培養基中央，28 ℃黑暗條件下培養3 d，每個處理3個重復。3 d后用十字交叉法測量菌落生長直徑。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定

對采集的26個玉米穗腐病穗進行分離、純化后，共獲得菌株56個，通過形態學和分子生物學鑒定得到3種鐮孢菌，分別為禾谷鐮孢（F.graminearum）、尖孢鐮孢（F.axysporum）和串珠鐮孢（F.verticillioides），以及多變根毛霉（Rhizomucor variabilis）和青霉菌（Penicillium spp.）。

根據病原菌分離物形態特征及在PDA和SNA平板培養基中的菌落形態等培養特征進行觀察（圖1），禾谷鐮孢菌在PDA培養基上菌絲紫色絮狀，菌落紫紅色，大型分生孢子比較長，頂部細胞漸尖。尖孢鐮孢菌在PDA培養基上菌絲白色絨毛狀，菌落粉白色，略帶有紫色；小型分生孢子數量較多，橢圓形，多無分隔；厚垣孢子呈球形，頂生。串珠鐮孢菌在PDA培養基上菌絲白色、棉絮狀，基部為淺粉色。小型分生孢子瓜子形，多串生，無分隔。在形態學鑒定過程中未觀察到大型分生孢子，且無厚垣孢子產生（圖2）。

2.2 分子生物學鑒定

經初步形態學鑒定，選取代表菌株，提取基因組DNA后，用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，得到500 bp左右的目的片段，將擴增后的產物送往上海英濰捷基公司測序，將測序結果（圖3）在GenBank 數據庫中比對，得出結果和形態學鑒定結果一致。

2.3 分離頻率

通過對鳳陽穗腐病的分離、鑒定，得到禾谷鐮孢菌25株，為安徽鳳陽地區的優勢病原菌，分離頻率為44.64%；尖孢鐮孢菌12株，分離頻率為21.42%；串珠鐮孢菌及多變根毛霉各8株，分離頻率為14.29%；青霉菌3株，分離頻率為5.36%。禾谷鐮孢菌為安徽省鳳陽縣玉米穗腐病病原菌的重要組成部分，應作為鳳陽縣玉米穗腐病的重點防治對象。

2.4 玉米穗腐病主要病原菌的生物學特性

2.4.1 溫度對病原菌營養生長的影響。

玉米穗腐病病原菌不同，對溫度的適應范圍也有所不同，總體來說，病原菌對溫度有較寬的適應范圍（圖4）。禾谷鐮孢菌Fg21菌絲在5～30 ℃均可生長，菌落平均直徑為2～65 mm。不同溫度下，菌落擴展速度不同，其中適宜溫度為20～28 ℃時菌落平均直徑為44～65 mm，最適宜溫度為25 ℃時菌落平均直徑為65 mm。高于30 ℃時生長速率減慢，菌落平均直徑為21 mm，35 ℃時菌絲停止生長。

串珠鐮孢菌Fv03菌絲在10～35 ℃均可生長，菌落平均直徑為9～38 mm。不同溫度下，菌落擴展速度不同，其中適宜溫度為25～28 ℃時菌落平均直徑為35～38 mm，最適宜溫度為25 ℃時菌落平均直徑為38 mm。5 ℃下菌絲停止生長，高于35 ℃生長速率減慢，菌落平均直徑為3 mm。

尖孢鐮孢菌Fa09菌絲在10～35 ℃均可生長，菌落平均直徑為5～44 mm。不同溫度下，菌落擴展速度不同，其中適宜溫度為25～30 ℃時菌落平均直徑為32～44 mm，最適宜溫度為28 ℃時菌落平均直徑為44 mm。5 ℃下菌絲停止生長，高于35 ℃時生長速率減慢，菌落平均直徑為10 mm。

2.4.2 pH對玉米穗腐病主要病原菌營養生長的影響。

pH為3.0時，PDA平板不能凝固，玉米穗腐病病原菌對酸堿度適應范圍很廣，pH在4.0～10.0時均可生長。禾谷鐮孢菌Fg21在pH 4.0～7.0時生長較快，菌落平均直徑為22～38 mm，pH高于7.0時，菌絲生長速度開始下降，最適合菌落擴展的pH為7.0；串珠鐮孢菌Fv03隨著pH的升高，菌絲生長速度逐漸增長，pH為10.0時，菌落直徑達到最大，為39 mm；尖孢鐮孢菌Fa09在pH為4.0～7.0時生長較快，菌落平均直徑為33～46 mm，pH高于7.0時，菌絲生長速度開始減慢，但pH為8.0～10.0時菌絲生長速度一致，菌落直徑一直穩定在43 mm，最適合菌落擴展的pH為7.0（圖5）。

2.4.3 玉米穗腐病主要病原菌對碳、氮源的利用。

玉米穗腐病病原菌都能利用多種碳源和氮源，在供試碳源和氮源中28 ℃下培養3 d均能生長。禾谷鐮孢菌Fg21生長較好的碳源為乳糖和可溶性淀粉，其次是甘露醇，菌落平均直徑≥32 mm；生長較差的碳源為果糖，菌落平均直徑為20 mm。串珠鐮孢菌Fv03在碳源中生長較好，菌落平均直徑在39～43 mm，其中在蔗糖和甘露醇中生長最好，菌落平均直徑為43 mm。尖孢鐮孢菌Fa09生長較好的碳源為麥芽糖，菌落平均直徑為40 mm；生長較差的碳源為葡萄糖，菌落平均直徑為29 mm（圖6）。

禾谷鐮孢菌Fg21生長較好的氮源為酵母膏，菌落平均直徑為43 mm；在硫酸銨和尿素中生長較差，菌落平均直徑為15～16 mm。 串珠鐮孢菌Fv03生長較好的氮源為蛋白胨，菌落平均直徑為44 mm；其次是酵母膏、硝酸鉀，菌落平均直徑為42 mm；生長較差的氮源為尿素，菌落平均直徑為16 mm。尖孢鐮孢菌Fa09生長較好的氮源為蛋白胨，菌落平均直徑為41 mm；其次是牛肉膏、酵母膏，菌落平均直徑為40 mm；生長較差的氮源為尿素，菌落平均直徑為15 mm（圖7）。由此可見，3種病原菌對氮源尿素的利用較差，尿素不利于3種鐮孢菌的生長。

3 結論與討論

該研究在安徽鳳陽玉米育種基地的發病玉米穗上分離到56株病原菌，通過鑒定得出：禾谷鐮孢菌25株，分離頻率為44.64%；尖孢鐮孢菌12株，分離頻率為21.42%；串珠鐮孢菌和多變根毛霉各8株，分離頻率為14.29%；青霉菌3株，分離頻率為5.36%。

由于引起玉米穗腐病原菌種類較多，各國各地報道的優勢種類也各不相同。國外報道，禾谷鐮孢菌（F .graminearum）和赤霉菌（Gibberella zeae）是玉米穗腐病的優勢種[17-18]，我國學者有的認為串珠鐮孢菌（F.moniliforme）為優勢菌株[19-22]，有的認為輪枝鐮孢為優勢病原菌[19，23-26]；該試驗對安徽鳳陽地區玉米穗腐進行了詳細的分離和鑒定，結果顯示禾谷鐮孢菌為鳳陽玉米穗腐病病原的主要病原菌，這與以上學者的報道有所不同，但與李順德等[27]的報道一致。由此可以看出，我國玉米產區不同，穗腐病致病鐮刀菌的優勢種群存在差異，這可能與各地區的栽培品種、栽培制度及氣候環境條件等不同有關。

從鐮孢菌的生物特性研究可以看出，禾谷鐮孢菌Fg21菌絲最適生長溫度為25 ℃，0～35 ℃存在最高溫度，5 ℃時該病菌可以緩慢生長，最適pH為7.0，最佳碳源是乳糖和可溶性淀粉，最佳氮源是酵母膏；串珠鐮孢菌Fv03和尖孢鐮孢菌Fa09在10～35 ℃均可生長，25 ℃是串珠鐮孢菌Fv03菌絲最適生長溫度， 隨著pH的升高，菌絲的生長越快，pH為10.0時菌落直徑達到最大，其最佳碳源是蔗糖和甘露醇，最佳氮源是蛋白胨；尖孢鐮孢菌Fa09最適生長溫度為28 ℃，最適pH為7.0，其最佳碳源是麥芽糖，最佳氮源是酵母膏。碳源對鐮孢菌營養生長影響相對穩定，而氮源對鐮孢菌營養生長影響的變幅較大。

通過對安徽鳳陽玉米穗腐病的研究，明確了禾谷鐮刀菌為鳳陽玉米穗腐病的優勢病原菌，這有利于摸清鳳陽地區玉米穗腐病的發生規律及其致病機理，從而更好地用于指導穗腐病的防治，為穗腐病抗病育種提供參考。

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