2個育性恢復基因Rf1a和Rf1b在紅蓮型水稻中的表達量分析

劉海青 楊夢醒 姜慧

摘要 [目的]探究紅蓮型水稻細胞質雄性不育（CMS）與不同恢復基因之間的作用模式。[方法]利用特異性引物結合熒光定量PCR技術，在紅蓮型水稻近等恢復基因系L-Rf5、L-Rf6，恢復系9311和不育系粵泰A（YTA）中檢測2個包臺型恢復基因Rf1a和Rf1b的表達量。[結果]Rf1a在L-Rf5、L-Rf6、9311中都能表達，而Rf1b只能在部分材料或部分組織中表達。對同一時期二者的表達量分析發現，L-Rf5和9311的相同組織中Rf1a表達水平顯著高于Rf1b，L-Rf6葉片中Rf1a的表達量則低于Rf1b。[結論]該研究結果對研究紅蓮型恢復系的遺傳多樣性具有一定的參考價值。

關鍵詞 Rf1a；Rf1b；細胞質雄性不育；熒光定量PCR

中圖分類號 S188+.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）25-0139-03

Abstract [Objective]To investigate the mode of action of cytoplasmic male sterility （CMS） and different restorer genes in Honglian type rice. [Method]The expression of Rf1a and Rf1b of BoroII were tested by fluorescence quantitative PCR in the LRf5， LRf6， the restorer line 9311 and the sterile line YuetaiA（YTA）. [Result]Rf1a can be expressed in all of them and Rf1b can only be expressed in partial of them. The expression level of Rf1a was significantly higher than Rf1b in LRf5 and 9311， and the expression of Rf1a in LRf6 was lower than that in Rf1b. [Conclusion]The results of this study have a certain value for the study of genetic diversity of the restorer gene in HLtype.

Key words Rf1a；Rf1b；Cytoplasmic male sterility；Fluorescence quantitative PCR

水稻細胞質雄性不育（CMS）是重要的種質資源。在對包臺型水稻雄性不育（BT-CMS）及其恢復機理的研究過程中發現其細胞質雄性不育由線粒體編碼的細胞毒素肽引起，2個含PPR蛋白基因中的任何一個均可破壞或降解細胞毒素肽使植株育性恢復，從而在分子水平解釋了包臺型水稻細胞質雄性不育及育性恢復性的機理[1]。在基因座Rf1處鑒定了2個含PPR蛋白的育性恢復基因Rf1a和Rf1b[2]。Rf1a和Rf1b是來源于同一個基因簇中的2個成員，定位于10號染色體上。研究人員對粳稻的28 000余份cDNA克隆并測序，得到Rf1a[3]。

在對紅蓮型水稻細胞質雄性不育（HL-CMS）的研究過程中，克隆并鑒定了2個有關的恢復基因Rf5和Rf6。Rf5定位于10號染色體上，其編碼的RF5是一種五肽重復區（PPR）蛋白，能夠與其配對蛋白（GRP162，識別編碼162個氨基酸的富含Gly的蛋白質）互作形成復合物RFC并結合atp6-orfH79，導致這個嵌合基因的轉錄產物降解，從而恢復育性[4]。Rf6定位于8號染色體上，其編碼的RF6與己糖激酶6（OsHXK6）結合，并且促進異常的CMS相關轉錄物atp6-orfH79降解，從而確保正常的花粉發育和育性恢復[5]。

比對HL-CMS的恢復基因Rf5與BT-CMS的恢復基因Rf1a的序列，發現這2個基因CDS區域完全相同，并且都能編碼1個由791個氨基酸組成的蛋白產物，產物包含有16 個三角狀五肽重復序列基序和線粒體定位信號肽。新的研究表明2個紅蓮型恢復基因Rf5和Rf6能夠恢復包臺型CMS[6]。該試驗在紅蓮型水稻中檢測到有包臺型恢復基因Rf1a和Rf1b后，利用Chen等[7]開發的InDel-Rf1a標記和Rf1b特異性引物，通過熒光定量PCR[8]的方法在紅蓮型水稻中對這2個基因的表達量進行分析，結果表明Rf1a在近等基因恢復系L-Rf5、L-Rf6，恢復系9311和不育系粵泰A（YTA）中都能表達，Rf1b只能在部分材料和組織中表達，這將為紅蓮型恢復基因的遺傳模式提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

紅蓮型水稻近等基因恢復系L-Rf5、L-Rf6，恢復系9311和不育系粵泰A（YTA），所有材料均來源于中南民族大學生物技術國家民委重點實驗室。

1.2 方法

1.2.1 水稻總RNA提取。

分別取紅蓮型水稻近等基因恢復系L-Rf5、L-Rf6，恢復系9311和不育系粵泰A（YTA）4種水稻幼苗期葉片和莖，加液氮磨碎成粉末狀，用TriZOL法提取總RNA，并完成RNA質量檢測。

1.2.2 cDNA的合成及檢測。

取2 μg總RNA，加入DNase I去除其中的DNA，利用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒反轉得到cDNA。以cDNA為模板用Rf1a和Rf1b的特異性引物，采用半定量PCR將cDNA濃度調成一致。

增片段長度都為180 bp左右。擴增體系為10 μL（H2O 6.7 μL，10×Buffer 1 μL，dNTP 0.8 μL，正向引物0.2 μL，反向引物0.2 μL，rTaq 0.1 μL，cDNA模板 1 μL）；擴增程序為95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，28次循環；72 ℃延伸1 min。

1.2.3 熒光定量PCR。

熒光定量PCR儀器為AB 7500Fast實時定量PCR儀（美國應用生物系統公司）。反應體系配制須在冰上且避光；設置引物濃度為0.6 μL（10 mmol/L），模板濃度為50 ng/μL；退火溫度為58 ℃。

反應體系：SYBR Green 7.5 μL，cDNA模板2 μL，H2O 4.3 μL，引物F 0.6 μL，引物R 0.6 μL。反應程序：95 ℃ 預變性30 s；95 ℃變性3 s，58 ℃退火30 s，95 ℃延伸15 s，40次循環；60 ℃預熱60 s，95 ℃變性15 s，60 ℃復性15 s。在每一循環的退火階段收集熒光，實時檢測反應并且記錄熒光信號的變化，得出擴增產物的熔解曲線。以水稻actin作為內參基因，根據熒光定量的數據計算2個基因Rf1a和Rf1b在不同材料不同組織中的表達量。

2 結果與分析

2.1 總RNA和cDNA質量檢測

采用Nanodrop2000微量分光光度計檢測提取得到的總RNA，濃度均約為2 500 ng/μL，A260/A280比值在1.90～2.00，A260/A230比值在1.90～2.20。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），結果顯示RNA質量（包括濃度與純度）良好，可以用于后續試驗。RNA反轉錄得到cDNA，并以cDNA為模板，PCR擴增actin，擴增結果顯示cDNA質量良好且無DNA污染（圖2）。

2.2 Rf1a和Rf1b在不同組織中表達量的檢測

根據熒光定量數據計算不同材料不同組織在同一時期2個基因的相對表達量（圖3、4）。在水稻幼苗期，Rf1a在L-Rf5、L-Rf6和9311中都有表達，其中表達量最高的是在L-Rf5的葉片中，所有試驗材料里，Rf1a在葉片中的表達量都要高于莖中的表達量；Rf1b的表達只有在L-Rf5的葉片、L-Rf6的葉片和莖中能明顯檢測到，其中L-Rf6葉片中表達量最高，其余試驗材料中沒有明顯檢測到這個基因的表達。

2.3 Rf1a和Rf1b表達量的對比分析

通過對同一時期不同材料和組織中的Rf1a和Rf1b基因表達量的對比（圖5），在水稻幼苗時期，L-Rf5和9311的相同組織中Rf1a表達水平顯著高于Rf1b，L-Rf6的葉片中Rf1a的表達量則低于Rf1b。在L-Rf5的莖，9311、YTA的葉和莖中，Rf1b都只有很少的表達量。

3 結論與討論

3.1 結論

該次試驗結果表明2個包臺型恢復基因Rf1a和Rf1b可以在紅蓮型水稻不育系和恢復系中表達，其表達量因材料或組織不同而不同。Rf1a在L-Rf5、L-Rf6，恢復系9311和不育系YTA中都能檢測到表達而且恢復系中的表達量顯著高于不育系。而Rf1b只能在近等基因系恢復系L-Rf5、L-Rf6中顯著表達，恢復系9311中表達量較少，不育系YTA中幾乎不表達。對同一時期二者的表達量分析，L-Rf5，9311的相同組織中Rf1a表達水平顯著高于Rf1b，L-Rf6的葉片中Rf1a的表達量則低于Rf1b。

3.2 討論

細胞質雄性不育（CMS）由線粒體基因組中的嵌合開放閱讀框引起，雄性不育可以通過核基因組中的育性恢復基因（Rf）恢復[9]。CMS/Rf系統已廣泛應用于雜交種子生產，有助于闡明植物中線粒體與核基因組之間的相互作用[10]。BT-CMS是由線粒體中orf79導致[2]，花粉育性的恢復是通過10號染色體上育性恢復基因Rf1調控。該調節基因Rf1（包括2個等位基因，Rf1a和Rf1b）已經被克隆并定位在Rf1位點[11-13]。Rf1a和Rf1b均編碼含有五肽復合物的蛋白質。具有多個恢復基因位點的配子體CMS/Rf系統開發的F1雜交后代可以產生超過50%的正常花粉粒并表現出良好的結實率[14]，這可能對BT型雜交育種非常有意義[15]。

紅蓮型的2個主要恢復基因Rf5和Rf6分別定位在10號和8號染色體[4-5，14]。Rf5編碼的RF5蛋白與其配對蛋白GRP162互作形成復合物RFC并結合atp6-orfH79，導致這個嵌合基因的轉錄產物降解，從而恢復育性[4]。Rf6編碼的RF6蛋白與己糖激酶6（OsHXK6）結合，并且促進異常的CMS相關轉錄物atp6-orfH79降解，從而確保正常的花粉發育和育性恢復[5]。在紅蓮型水稻中，這2個基因表現出相似的恢復能力[14]。

已有的證據顯示，在9311內，與BT-CMS相關的2個基因正是Rf5和Rf6[6]。BT-CMS中這2個基因的恢復能力測試結果為熱激條件下Rf6的恢復能力比Rf5更穩定[6]。通過比對已公布的Rf1a和Rf5的序列，證實二者為同一基因。水稻育種試驗揭示了HL-CMS與BT-CMS恢復和保持關系的相似性[16]。因此推斷2個包臺型恢復基因Rf1a和Rf1b在HL-CMS中有恢復作用。此次試驗結果顯示在同一時期相同材料的相同組織中，Rf1a比Rf1b具有明顯高的表達量，一個可能的假設是這2個基因的恢復活性存在差異，恢復活性的差異是由于恢復的分子機理不同。這個假設需要更多的試驗來證實。

參考文獻

[1] 張啟發.中國科學家闡明Boro II型水稻細胞質雄性不育和育性恢復的分子機理[J].分子植物育種，2006，4（4）：451-452.

[2] WANG Z H，ZOU Y J，LI X Y，et al.Cytoplasmic male sterility of rice with boro II cytoplasm is caused by a cytotoxic peptide and is restored by two related PPR motif genes via distinct modes of mRNA silencing[J].The plant cell，2006，18（3）：676-687.

[3] KIKUCHI S，SATOH K，NAGATA T，et al.Collection，mapping，and annotation of over 28，000 cDNA clones from japonica rice[J].Science，2003，301（5631）：376-379.

[4] HU J，WANG K，HUANG W C，et al.The rice pentatricopeptide repeat protein RF5 restores fertility in HongLian cytoplasmic malesterile lines via a complex with the glycinerich protein GRP162[J].The plant cell，2012，24（1）：109-122.

[5] HUANG W C，YU C C，HU J，et al.Pentatricopeptiderepeat family protein RF6 functions with hexokinase 6 to rescue rice cytoplasmic male sterility[J].Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America，2015，112（48）：14984-14989.

[6] ZHANG H G，CHE J L，GE Y S，et al.Ability of Rf5 and Rf6 to restore fertility of chinsurah boro IItype cytoplasmic male sterile Oryza sativa（ssp.Japonica）Lines[J].Rice，2017，10（1）：2.

[7] CHEN T，ZHANG Y D，ZHU Z，et al.Development of new InDel marker to detect genotypes of Rf1a conferring fertility restoration of BTtype cytoplasmic male sterility in rice[J].Rice science，2014（1）：13-19.

[8] RUBIOPI A J，QUIROZMORENO A，SNCHEZTEYER F.A quantitative PCR approach for determining the ribosomal DNA copy number in the genome of Agave tequila Weber[J].Electronic journal of biotechnology，2016，22：9-15.

[9] HANSON M R，BENTOLILA S.Interactions of mitochondrial and nuclear genes that affect male gametophyte development[J].The plant cell，2004，16（6）：154-169.

[10] CHASE C D.Cytoplasmic male sterility：A window to the world of plant mitochondrialnuclear interactions[J].Trends in genetics，2007，23（2）：81-90.

[11] KAZAMA T，TORIYAMA K.A pentatricopeptide repeatcontaining gene that promotes the processing of aberrant atp6 RNA of cytoplasmic malesterile rice[J].FEBS letters，2003，544（1/2/3）：99-102.

[12] AKAGI H，NAKAMURA A，YOKOZEKIMISONO Y，et al.Positional cloning of the rice Rf1 gene，a restorer of BTtype cytoplasmic male sterility that encodes a mitochondriatargeting PPR protein[J].Theoretical and applied genetics，2004，108（8）：1449-1457.

[13] KOMORI T，OHTA S，MURAI N，et al.Mapbased cloning of a fertility restorer gene，Rf1，in rice（Oryza sativa L.）[J].The plant journal，2004，37（3）：315-325.

[14] HUANG W C，HU J，YU C C，et al.Two nonallelic nuclear genes restore fertility in a gametophytic pattern and enhance abiotic stress tolerance in the hybrid rice plant[J].Theoretical and applied genetics，2012，124（5）：799-807.

[15] FUJII S，TORIYAMA K.Suppressed expression of RetrogradeRegulated Male Sterility restores pollen fertility in cytoplasmic male sterile rice plants[J].Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America，2009，106（23）：9513-9518.

[16] LI S Q，YANG D C，ZHU Y G.Characterization and use of male sterility in hybrid rice breeding[J].Journal of integrative plant biology，2007，49（6）：791-804.