食源性病原及其毒素檢測技術研究進展

陳念 趙斌 王乾蕾

摘要 食源性病原包括細菌、真菌、病毒、朊病毒和原蟲，它們在生產加工及儲運環節污染食物，同時不斷分泌包含毒素在內的各種成分到細胞外直至自身死亡和裂解，其中一些病原菌及其毒素能耐受復雜的食物加工，直至進入人體干擾細胞生理過程并引發疾病。詳細介紹了如何利用各種“組”學（包括蛋白質組、肽組、代謝組和食品組學）技術檢測和尋找食源性病原微生物的生物標志物，深入了解其產毒機理、毒力和致病機理，及對脅迫的適應能力。這對于追蹤食源性病原微生物內、外毒素的來源，保證食品安全并控制食源性疾病爆發具有重要意義。

關鍵詞 食源性病原；細菌；真菌；毒素；蛋白質組學

中圖分類號 TS207 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）25-0099-06

Abstract Pathogens from food are mainly bacteria， fungi and some viruses， prions and protozoa， they contaminate food during production， processing， storage and transportation. These microorganisms could secrete many toxins into the extracellular environment. Some bacteria and fungal toxins are resistant to inactivation， and can survive during food preparation. These chemicals are always involved in the pathogenesis. This paper reviews the use of proteomics， peptidomics and metabolomics， in addition to other food omics methods for the detection of pathogenic fungi and bacteria， and their biomarkers. These techniques were useful for discovering the pathogenicity of foodborne pathogens， determining their function mechanisms， and monitoring food safety and prevent the outbreak of foodborne diseases.

Key words Foodborne pathogens；Bacteria；Fungus；Mycotoxins；Proteomics

近年來，隨著食品貿易的全球化發展，以及鼓勵生鮮、干貨和新奇食材等新的營養消費趨勢，使得食源性疾病的發生頻率顯著增加。人食源性疾病主要由食源性病原（細菌、真菌、病毒和寄生蟲）及其毒素污染食物所引起，這些疾病極易擴散并引發廣泛的公共健康問題[1]。2013年，歐盟共報道了5 196起食源性疾病事件，引起43 183人感染、5 946人住院治療、11人死亡；代表性的如德法兩國近年來頻繁發生志賀毒素（Shiga toxin）食源性食物中毒事件。在美國，每年約有940萬起食源性疾病事件發生，引起55 961人住院、1 351人死亡。

檢測食物病原并保護食物免于腐敗變質對于維護公共健康具有重要意義，由于病原通常還能產生致病性毒素，因此只有同時檢測病原及其毒素才能保證食物安全。部分食物病原及其毒素具耐熱性，常規的食物加工和制備方法很難完全將其破壞，使得食物的安全控制變得更加復雜化[2]。在食物的生產、儲存和運輸階段，以蛋白質組、肽組和代謝組為代表的食物組學分析技術已成功用于鑒定食物樣品中的食源性病原及其毒素，筆者對近年來相關領域的進展進行了綜述。

1 細菌性食物病原及細菌毒素

1.1 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）分析細菌特征

一直以來常用的表型鑒定方法（如菌落特征、選擇性平板、生化特征、革蘭氏染色）因較耗時，而逐漸被效率更高、更準確和可靠的MALDI-TOF-MS方法所取代用于細菌鑒定，后者僅需將細菌菌落引入MALDI平板，用胰蛋白酶消化核糖體或細胞內蛋白，將得到的部分或完整細菌細胞MALDI-TOF-MS肽指紋譜與標準光譜數據庫中的數據進行匹配，即能準確鑒定菌種。副結核分枝桿菌亞種（Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis，MAP）能感染反芻動物并引起類結核，該耐熱菌還易通過牛奶傳遞給人，過去常用酶聯免疫吸附法（ELISA）鑒定牛MAP，但該方法因敏感性較低而難以檢測早期感染，還會與環境中的分枝桿菌發生交叉反應。為了滿足臨床早期、快速、準確檢測產毒菌株的要求，以2D凝膠電泳+質譜、MALDI-TOF-MS為代表的蛋白質組方法已經逐漸得到推廣應用（表1）。

目前，MALDI-TOF-MS應用于食品檢測的技術瓶頸主要在于微生物分離和培養，尤其對于厭氧、生長條件苛刻或生長緩慢的菌株，建議對于此類無法培養或難以培養的毒株，如霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic E.coli）、弗氏志賀菌（Shigella flexneri）和腸道沙門氏菌（Salmonella enterica），可針對性地開發相關的樣品制備協議。值得一提的是，一方面，某些細菌可能不會對人類健康造成威脅，但其分泌的蛋白可能對人體具有強烈的毒性；另一方面，MALDI-TOF-MS技術僅能檢測食物是否染菌，但無法獲知毒素編碼基因表達或毒素含量相關的信息。

1.2 應用蛋白質組學技術檢測細菌毒素

細菌毒素分為內毒素和外毒素，前者為脂多糖，位于G-細菌外膜，細菌生長時很少分泌，但在自溶或受外界因素（如抗生素、宿主免疫噬菌細胞）影響溶菌后則易被釋放，因此，其通常在細菌生長后期作用，中等毒性且對熱穩定；后者為G+或G-細菌分泌的蛋白（某些外毒素僅當細菌裂解時才釋放），常通過酶促反應起作用，威脅和特異性均強于前者，而且可在遠離細菌生長的位置遠程發揮作用。2013年，歐洲有約16%的食源性事件都是由主要來自蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、肉毒梭狀芽孢桿菌（Clostridium botulinum）、產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的細菌外毒素所引起的。

1.2.1 不依賴凝膠的蛋白質組學方法。

葡萄球菌腸毒素（Staphylococcal enterotoxins，SE）是金黃色葡萄球菌產生的耐胃腸道蛋白酶解的外毒素，耐熱、酸和pH變化，加工過程中較穩定，分23種血清型，其中SEA和SEB引起的葡萄球菌食源性疾病各占80%和10%。衛生條件是SE污染食物的主要原因，目前SE檢測主要采用免疫親和技術，也有使用MALDI-TOF-MS，前者要求提前制備腸毒素特異性抗體（目前僅可獲得SE A-E、G、H和Q），技術流程復雜且成本高昂，制備的抗體還常與腸毒素性質相似的分子發生交叉反應。一種無需標記的同位素稀釋LC ESI MS/MS方法被用于檢測牛奶和蝦中的SEA和SEB，檢測限達2.5 ng/g（SEA）和5.0 ng/g（SEB）。Sospedra等[6]使用單級三重四極質譜代替串聯質譜檢測牛奶和果汁中的SEA和SEB，可能由于樣品制備誤差使檢測限減少了一個數量級。Dupre等[9]用同樣的方法定量人體液和食物中的SEB、蓖麻毒素（Ricin）和內毒素（ETX），檢測限低至1 ng/mL。

食物中多數外溢蛋白（exo proteins）能耐熱加工處理，但部分肉毒桿菌（C.botulinum）株系產生的致死性極強的肉毒菌神經毒素（Botulinum neurotoxin，BoNT，自身具蛋白水解酶活性）則極易受熱變性。一直以來，小鼠活體注射生物分析法被作為BoNT定量檢測的金標準，但存在誤差大、成本高和倫理學等缺點；免疫學方法（如ELISA）敏感性高，但易發生交叉反應或假陽性。內肽酶活力分析法（Endopeptidase activity assays）基于BoNT固有的水解酶活性，偶聯質譜儀與反應室可快速檢測底物分裂位置，被用于鑒定血清型。Kuklenyik等使用MALDI-TOF-MS、HPLC-ESI-MS/MS和內肽酶活力分析法對具酶催化活性的炭疽病致死因子定量測定的效果進行了比較，其中同位素稀釋MALDI-TOF-MS方法更快、更準確可靠。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種產芽孢的G+細菌，污染面粉、面包和酵母且耐烘烤，萌發的孢子能引起面包變質，結合無標記定量LC-MS-MS和生物信息學分析，對生長受抑制情況下枯草芽孢桿菌的蛋白質組變化進行研究，檢測到的差異表達的蛋白主要為涉及蛋白質合成和能量代謝的酶和輔因子，以及包含熱激蛋白在內的分子伴侶；結合2DE、DIGE和iTRAQ分析，使用多元定量方法對抗微生物劑桃拓酚（Totarol）處理后枯草芽孢桿菌的變化進行分析，共鑒定了139種差異表達的蛋白，其中涉及中心代謝、無氧呼吸、亞鐵血紅素生物合成及細胞內環境穩定的關鍵酶的表達均顯著下調。利用LC-MS對艱難梭狀芽胞桿菌（Clostridium difficile，可形成孢子的G+細菌，能感染人結腸引起腹瀉）的分泌蛋白質組（Secretomes）進行研究，在上清液中鑒定了158種蛋白。Ternan等使用LC-MS基于“指數改良的蛋白質豐度指數（exponentially modified protein abundance index，emPAI）”光譜計數方法測定了熱脅迫（從37 ℃提高到41 ℃）響應下的蛋白質組變化，有65個蛋白（37%）變化程度超過1.5倍，41 ℃時運動相關的鞭毛絲蛋白表達減少了2.7倍。

沙門氏菌屬的沙門氏腸菌（Salmonella enteritis）和S.bongori是重要的全球性食源性病原，前者為細胞內病原，在宿主細胞內的膜結合區——沙門氏菌囊泡（Salmonella containing vacuoles，SCVs）進行復制。傷寒沙門桿菌（S.typhi）及其他非傷寒血清型可分泌傷寒毒素（Typhoid toxin），該細胞致死膨脹毒素（Cytolethal distending toxin，CDT）由CdtB（DNaseI樣催化活性）、PltA（ADP核糖基化活性）和PltB 3個亞基組成（Plt對于CdtB的分泌是必需的），通過結合含N-乙酰神經氨酸末端的多糖鏈的細胞而產生毒性。產志賀毒素的E.coli O104∶H4可能對人造成致命傷害，而其他無毒的大腸桿菌菌株則常被作為工業或模式微生物，相關的蛋白質組已進行了大量研究，如不同生長階段蛋白質改變以及各種抗微生物試劑對它們的影響。單核細胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，G+）是食物加工的主要污染菌，適應溫度范圍廣，其毒性主要來自李斯特菌溶血素（Listeriolysin O，外毒素），抑制劑對其蛋白質組的影響已使用LC-MS/MS和定量無標記LC-MS/MS進行了研究。細菌小腸結腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica，G-）及其腸道毒素Yst感染主要來自生的水果和蔬菜，耐低溫冷藏，可引起小腸結腸炎。彎曲菌屬（Campylobacter）的空腸彎曲桿菌（C.jejuni）常引起人急性感染性痢疾，其發病率甚至超過沙門氏菌屬，與其他細菌不同，空腸彎曲桿菌兼具N-連接和O-連接2個糖基化系統，其糖蛋白含有細菌特異性的單糖“Pseudaminic acid（一種類似唾液酸的糖衍生物）”和“Diacetamidobacillosamine”，這對于其特異性檢測非常重要。

1.2.2 基于凝膠的蛋白質組學方法。

分泌蛋白質組研究有助于闡明細菌中各種蛋白組分的致病機理，為了富集低豐度蛋白，常首先利用LC或凝膠電泳等方法對完整的蛋白質組進行預分級。以牛奶蛋白為例，蛋白混合物經SDS-PAGE分離后，將切割下來的電泳條帶用胰蛋白酶消化后提取并測定SEA，鑒定了19種標準SEA胰蛋白酶水解肽（序列蓋度73%）。Enany等[24]用SDS-PAGE和強陽離子交換樹脂對甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，MRSA）的分泌蛋白質組進行預分級后再用串聯質譜分析，鑒定了174種蛋白，隨后又結合SDS-PAGE和LC-MS/MS對MRSA和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌（MSSA）的分泌蛋白質組進行比較研究，分別鑒定了261種（MRSA）和168種（MSSA）細胞外蛋白，其中144種由MRSA獨有，其中極可能含有該菌株的毒力因子。Quiblier等[25]用LC-MS/MS對分泌途徑輔助蛋白SecDF研究發現，secDF缺失在引起胞外蛋白質組（exoproteome）變化的同時，金黃色葡萄球菌對宿主細胞的吸附、入侵和毒性也同時下降。使用SDS-PAGE預分級組合“LTQ Orbitrap XL”質譜儀對蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）secDF敲除突變體的分泌蛋白質組進行研究，也發現同樣的變化，突變體分泌蛋白質組中3種最常見的痢疾腸道毒素水平均低于野生型。蠟樣芽孢桿菌天然生長于低氧的小腸環境，對其在3種不同培養條件下（低氧化還原電勢-Oxireduction potenial/ORP + 缺氧、高ORP + 缺氧、有氧）的分泌蛋白質組進行比較，共鑒定了57種分泌性毒力相關蛋白（其中新發現31種）。

利用2D凝膠電泳偶聯MALDI-TOF/TOF對產氣莢膜梭菌（C.perfringens）A、C型菌株的胞外蛋白質進行比較，發現了一些在其他G+細菌胞外蛋白質組中從未報道過的蛋白，SagA蛋白、DnaK型分子分子伴侶hsp70、內β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶作為分泌豐度最高的蛋白，可作為食物樣品中產氣莢膜梭菌的檢測標記（進化保守且與最近相似蛋白同源性低至≤50%）。

2 真菌性食物病原與真菌毒素

在真核食物病原中，產毒微藻的毒力最強但食用較少，毒力相對較弱的食源性病原真菌與細菌一起共同構成食物變質最常見的原因。病原性真菌主要來自青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）等絲狀真菌，由于栽培、加工或儲藏不當等因素，其感染可食用植物和飼料后合成真菌毒素，并通過食物鏈繼續傳遞給動物或人。

Braaksma等[26]結合SDS-PAGE與LC-MS/MS，鑒定了黑曲霉（A.niger）生長相關聯的分泌蛋白質組；Ji等[27]用凝膠電泳與Q TOF分析了禾谷鐮刀菌（F.graminearum）分泌蛋白質組，鑒定了87種蛋白（其中63種與生物信息學預測結果一致）。一種類似SDS-PAGE升級版的“Blue Native（BN）-PAGE”技術被用于鑒定哈茨木霉（Trichoderma harzianum）分泌蛋白質組；同位素標記相對和絕對定量（Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）被用于定量煙曲霉菌（A.fumigatus）、黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）和里氏木霉（Trichoderma reesei）的分泌蛋白質組；將穩定同位素加入生長培養基中的代謝標記方法也較常用，如氨基酸同位素標記（Stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）被用于研究釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）蛋白質組[28]；除了化學標記和代謝標記外，還有一種無標記的MS方法也被用于定量研究嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca）和豌豆銹病菌（Uromyces appendiculatus）的分泌蛋白質組，兩者分別采用了基于emPAI和“歸一化光譜豐度因子（Normalized spectra abundance factor，NSAF）”的不同的光譜計數方法。

控制真菌毒素風險最可靠的方法是防止真菌生長，消除肉眼可見的真菌不代表就沒有真菌毒素，許多真菌毒素能抵抗復雜的食品加工過程并長時間存留于食物中，因此，檢測真菌毒素比檢測分泌毒素的真菌更為重要。近年來有關利用蛋白質組技術檢測食物中常見真菌毒素的報道參見表2。

目前，全球已鑒定了≥400種真菌毒素，其中研究最多也是最常見的來自食源性真菌的低分子量毒素包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、棒曲霉素，以及包含伏馬菌素（Fumonisins）、玉米烯酮（Zearalenone，ZEN）、單端孢霉烯族毒素（Trichothecenes）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）在內的鐮刀菌真菌毒素。天然環境中真菌毒素最主要的功能是抑制和殺滅周圍的競爭性微生物，這些次生代謝物即使在低濃度對于動物和人也常具有毒性，表現為細胞毒性、致癌或致畸變，可引起嚴重的健康問題。許多真菌毒素都是耐熱的，因此很難完全控制其污染，常見的方法有抑制真菌生長、食品凈化和脫毒，此外，加入胃腸道真菌毒素結合劑（減少其生物利用度）或添加有益的腸道細菌（使毒素在吸收前即降解或酶法轉化為低毒化合物），也是值得推薦的控制真菌毒素危害的方法。

2.1 待檢樣品的制備

檢測食物中真菌毒素的第1步是選取和制備樣品。正確的清潔樣品對于獲得準確、可靠的試驗數據非常重要，尤其對于極低濃度的目標化合物。“Dilute & Shoot”是最簡單的制備真菌毒素待檢樣品的方法，即將樣品稀釋后不經過濾清潔直接注射入LC。固相萃取（Solid phase extraction，SPE）是最常用的預濃縮真菌毒素樣品的方法。Campone等[32]使用加壓溶劑提取和在線 SPE提取偶聯UHPLC-MS/MS全自動檢測干燥水果中的黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A（OTA）。Tolgyesi等[44]使用聚合物柱SPE結合LC-MS/MS對小麥、番茄汁和太陽花種子中的鏈格孢屬（Alternaria）毒素進行分離和定量，包括交鏈孢霉烯（Altenuene）、鏈格孢毒素（Tentoxin）和細交鏈孢菌酮酸（Tenuazonic acid，TeA）等，定量范圍達1～10 μg/kg，但該方法存在耗時、耗費大量有機溶劑且成本高等缺點。采用SPE方法時，固定相的吸附作用會造成樣品損失，且固相與樣品間的相互作用還受pH和溶劑類型等因素的影響，基于SPE升級而來的固相微萃取（Solid phase microextraction，SPME）技術使溶劑用量減少至幾毫克，該方法已用于堅果、小麥、玉米和谷物中OTA和OTB的測定。

分散液液微提取（Dispersive liquid liquid micro extract，DLLME）和QuEChERS——“Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe”是2種較新出現的提取方法，適合同時分析多種真菌毒素：①DLLME升級自液液提取（Liquid liquid extraction，LLE）技術，該技術簡單、高效，且溶劑消耗量遠低于后者；DLLME偶聯LC MS/MS被用于測定水樣中的6種雌激素、玉米中的ZEN，以及稻米中的黃曲霉毒素（AFB）和OTA。②QuEChERS方法制備樣品僅需“三步”——加入溶劑、用鹽將水隔開、使用分散SPE清洗；QuEChERS偶聯LC-MS/MS已成功用于多種真菌毒素的同時檢測，如雞蛋（ZEN、DON、AFB1及其代謝物）和酒（36種真菌毒素）[47]。

2.2 免疫化學與色譜檢測方法

免疫化學與色譜是2類最常用的真菌毒素檢測方法，其中免疫化學方法以表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）和ELISA為代表，兩者均依賴于針對真菌毒素的特異性抗體：①SPR生物傳感器[48]。將分子印跡聚合物通過單鏈的DNA或RNA寡聚核苷酸適配體固定在SPR芯片表面，可檢測DON、紅曲米中的橘霉素；Zhu等[49]將OTA靶向適配體經生物素與固定于傳感器芯片表面的鏈霉親和素交聯，定量檢測酒和花生油中的OTA。②ELISA[50]。基于單克隆抗體的間接競爭性ELISA（IC ELISA）技術被用于定量檢測玉米青貯飼料中的蕈青霉素（Paxilline）和OTA、稻米稻曲球和水稻籽粒中的稻曲毒素（Ustilotoxin B）。③其他。如免疫親和柱偶聯熒光光度計測定肉制品中的真菌毒素；熒光極化免疫分析（Fluorescence polarization immunoassay）快速篩選啤酒中的黃曲霉毒素B1。

無論是單克隆抗體、適配體還是免疫親和柱，均依賴于真菌毒素與其特異性配體之間特異性的相互作用，這也使得免疫化學方法主要適于單個真菌毒素的檢測，而對于含多種真菌毒素的復雜樣品，則推薦使用色譜方法。最常用的色譜學方法是LC偶聯MS或隨機MS/MS。Serrano等[51]使用LC ESI MS/MS技術對65份稻米樣品中的鐮刀菌真菌毒素白僵菌素（Beauvericin，BEA）、恩鐮孢菌素（Enniatins，ENNs，分A、A1、B、B1 4種組分）、Fusaproliferin和串珠鐮刀菌素（Moniliformin）進行了分析，在26份樣品中均檢測含有BEA，ENNs僅檢測到了A1組分，后兩者未檢測到。Escriva等[40]使用GC-MS/MS從鼠飼料中檢測到了7種單端孢霉烯族毒素，其中DON存在最普遍，然而，因為真菌毒素是極性化合物，使用GC分析需額外增加衍生化步驟，所以已逐漸被LC所取代。

在食品安全評價領域，隨著MS離子化技術“MALDI-TOF和ESI-MS”的不斷發展，以軌道阱質譜儀為代表的高分辨率質譜（High resolution mass spectrometers，HRMS，分辨率可高達1萬、質量準確度≤5 mg/kg）將逐漸成為檢測食物中真菌毒素的首選方法。Dominicis等[52]使用UHPLC結合單級軌道阱定量測定了牛奶和小麥粉中的33種真菌毒素、殺蟲劑和抗生素；同樣的方法還成功測定了谷類中的T2和HT2毒素及其糖基化衍生物，以及玉米中的伏馬菌素。在定量檢測方面，建議選擇同位素稀釋（Isotope dilution，ID）LC-MS作為內標（其基于信號比代替信號強度），該方法已被用于檢測自制豆瓣醬中的OTA、蘋果中的棒曲霉素，甚至人尿液中的TeA。

3 小結與展望

以蛋白質組、肽組、代謝組為代表的各種食物組學技術，為更有效地監控食品生產、運輸和存儲過程中食源性病原及其毒素的污染提供了強大的技術手段。高通量樣品制備方法及MALDI-TOF-MS技術的發展將進一步促進這些技術在常規食品樣品分析中的使用。隨著軌道阱和傅里葉變換離子回旋MS技術的發展，超高分辨率質譜（Ultra high resolution mass spectrometry，UHRMS）的分辨能力將實現超過10萬級別，并進一步促進LC-MS-MS在毒素分析與鑒定疾病生物標記物中的廣泛應用。

當然，傳統的以免疫化學為代表的微生物及其毒素檢測方法，在常規使用中依然存在巨大的潛力可供挖掘，尤其是小型化和新的高通量技術的應用，將進一步降低檢測限、減少樣品和溶劑用量，同時顯著縮短分析時間[53]。值得一提的是，對于真菌毒素，除了致病威脅外，某些還具有利用價值，如麥角菌屬真菌產生的麥角生物堿可作為醫藥原料生產抗偏頭痛藥物、催乳激素（Prolactin）抑制劑或抗帕金森病藥物，這些方向都值得進一步深入研究。

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