不同制備方法對金櫻子多糖體外抗氧化活性的影響

陳傳平 吳劍鋒 方士英 彭成

摘要[目的]探討不同制備方法提取的金櫻子多糖體外抗氧化活性。 [方法]采用DPPH自由基、羥自由基（·OH）及脂質(zhì)氧化體系作為體外抗氧化模型，測定金櫻子粗多糖、水溶性多糖、脂溶性多糖及混合多糖清除DPPH自由基和·OH的清除率及脂質(zhì)抗氧化能力。[結(jié)果]在一定濃度范圍內(nèi)，隨著各組待測溶液中多糖濃度的提高，清除DPPH自由基及·OH的能力逐步增強，其中混合多糖活性最高；在脂質(zhì)抗氧化能力方面，脂溶性多糖活性最強。[結(jié)論]金櫻子多糖具有良好的抗氧化能力，不同制備方法所得的金櫻子多糖抗氧化活性不同。

關(guān)鍵詞金櫻子；多糖；制備方法；體外抗氧化活性

中圖分類號R285文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）35-0116-03

Abstract[Objective] The research aimed to discuss the antioxidant activity in vitro of Rosa lacvigata polysaccharides extracted by different preparation methods.[Method]Using DPPH radical， hydroxyl radical （·OH） and lipid oxidation systems as in vitro antioxidant models， the DPPH radical and ·OH scavenging antioxidant activity as well as lipid antioxidant capacity of crude polysaccharide， watersoluble polysaccharide， fatsoluble polysaccharide and mixed polysaccharides from Rosa laevigata were analyzed.[Result]In a certain concentration range， with the polysaccharides concentration increased， the DPPH radical and ·OH scavenging capacity raised obviously， and the mixed polysaccharides group had the highest activity. The lipidsoluble polysaccharides showed the highest antioxidant capacity in lipid oxidation resistance.[Conclusion] Rosa laevigata polysaccharides have good antioxidant ability， the antioxidant activity of Rosa laevigata polysaccharides obtained by different preparation methods is different.

Key wordsRosa laevigata Michx；Polysaccharide；Preparation methods；Antioxidant activity in vitro

金櫻子（Rosa laevigata Michx）又稱刺榆子、山石榴、金壺瓶等，為薔薇科常綠攀緣植物金櫻子的果實，在我國南方地區(qū)分布廣泛 [1]。作為傳統(tǒng)中藥，《本草綱目》記載金櫻子“性酸、澀 、平 、無毒；主治脾瀉下痢 、止小便利 、澀精氣，久服，令人耐寒輕身，補血益精，有奇效”[2-3]。現(xiàn)代藥理研究表明，金櫻子多糖作為其主要活性成分之一，能顯著消除超氧陰離子自由基及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的形成，有明顯的抗氧化作用[4-6]，但報道主要圍繞金櫻子水溶性多糖而進行。李玲等[7]研究表明金櫻子乙醇提取物也有較強的抗氧化活性。筆者分別對金櫻子水溶性多糖和脂溶性多糖進行提取、純化，研究其清除DPPH自由基、羥自由基（·OH）的能力及脂質(zhì)抗氧化作用，并對結(jié)果進行比較，為深入開發(fā)利用藥用金櫻子資源提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試材。

試驗材料金櫻子于2015年11月采自安徽省霍山縣，品種經(jīng)皖西學院生物與制藥工程學院相關(guān)專家鑒定為金櫻子（Rosa laevigata Michx）。

1.1.2

主要儀器。TU-1901 雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；HH-S6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；TGL-20M臺式高速冷凍離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；GL-20G-Ⅱ電子分析天平（上海安亭科學儀器廠）；202A-3型數(shù)顯電熱干燥箱（上海錦屏儀器儀表有限公司）；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海洪旋實驗儀器有限公司）；SHB-Ⅲ S型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城料工貿(mào)有限公司）；FD-Ⅰ 型冷凍干燥機（北京博醫(yī)康公司）。

1.1.3主要試劑。三氯甲烷（衢州市西隴化工股份有限公司）、正丁醇（天津博迪化工股份有限責任公司）、硫酸（國藥集團化學試劑有限公司）、無水乙醇（上海振興化工一廠）、無水乙醚（上海振興化工一廠）、丙酮（衢州市西隴化工廠有限公司）、DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），所有試劑均為AR。

1.2方法

1.2.1金櫻子粗多糖的提取。

金櫻子原料洗凈，去籽90 ℃烘干至恒重，粉碎過40目篩后，置于索氏提取器中石油醚回流脫脂（60 ℃，2 h），揮干溶媒。精密稱取脫脂金櫻子粉末3份各150 g，同時進行平行操作，分別加入適量蒸餾水，95 ℃回流提取3 h，收集提取液得粗多糖液。

1.2.2金櫻子多糖的純化分離。

在水浴70 ℃下，將多糖提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮至原體積的1/3左右，可見有明顯沉淀，冷卻至室溫后，按照浸提液∶H2O2=5∶1的體積比加入H2O2，并于50 ℃保溫2 h進行脫色，再經(jīng)透析、Sevag法脫蛋白[8-9]、洗滌后得金櫻子混合多糖液。

取混合金櫻子多糖液按1∶4體積比加入95%乙醇，放入冰箱內(nèi)（4 ℃）靜置24 h過夜，4 000 r/min離心15 min，收集沉淀加適量的去離子水溶解得金櫻子水溶性多糖；離心后上清醇溶液減壓濃縮得脂溶性多糖。

1.2.3多糖的定性鑒定。

采用Molish反應(yīng)方法，若在糖液和濃硫酸的液間形成紫環(huán)（Molish反應(yīng)），即定性鑒定金櫻子多糖的存在。

1.2.4多糖含量的測定與待測溶液配制。

采用蒽酮-硫酸比色法，利用回歸方程求各樣品溶液中葡萄糖濃度，折合并計算出金櫻子粗多糖、混合多糖、水溶性多糖及脂溶性多糖的質(zhì)量濃度，再配制成相應(yīng)不同濃度待測溶液[10]。

1.3金櫻子多糖抗氧化性的測定

1.3.1清除DPPH自由基的能力測定。

根據(jù)文獻[11]，精密稱取0.007 9 g DPPH用無水乙醇定容到100 mL，即得0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液。在試管中分別加入2 mL不同質(zhì)量濃度的（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）金櫻子多糖溶液及等體積的DPPH乙醇溶液，混勻后于暗處靜置30 min，以無水乙醇為參比，在波長517 nm處測定其吸光度（A）。平行測定3次，取平均值。按下式計算清除率：

清除率=[（1-A2-A1）/A0]×100%

式中，A0為2 mL DPPH溶液+2 mL無水乙醇測定的吸光度；

A1為2 mL無水乙醇+2 mL樣品溶液測定的吸光度；

A2為2 mL DPPH溶液+2 mL樣品溶液測定的吸光度。

1.3.2·OH清除率的測定。

分別配制0.15 mmo1/L FeSO4溶液、2 mmo1/L水楊酸溶液及6 mmo1/L H2O2溶液各100 mL；樣品組試管中加入FeSO4溶液、水楊酸溶液、H2O2溶液及上述不同濃度的多糖溶液各1 mL，空白組用蒸餾水代替多糖溶液，對照組用蒸餾水代替水楊酸；設(shè)3份平行，結(jié)果取平均值。以上試管編號放入水浴鍋中37 ℃恒溫水浴30 min后，取出冷卻，在分光光度計510 nm處用蒸餾水調(diào)零，測定平均吸光度（A），用下式計算多糖對·OH的清除率[12]：

清除率=[A空白-（A樣品-A對照）]/A空白×100%

1.3.3脂肪過氧化值（POV值）的測定。

精密稱取PG 50 mg，用適量60%乙醇溶解后，與1.0 mg/mL的各種金櫻子多糖溶液混合，分別加入到裝有50 g經(jīng)熔化處理豬油的碘量瓶中，在65 ℃下攪拌30 min，使其均勻分散在油樣中。塞緊瓶塞，置于65 ℃恒溫箱中保存5 d。每隔24 h，將瓶中的油樣攪拌均勻，測定其POV值（GB/T5009.37—1996油脂衛(wèi)生標準）[13]。以抗氧化劑的油樣為空白對照。平行3份，取平均值。計算公式如下：

POV=1 000 ×（V1-V2）×C/M

式中，V1為試樣消耗Na2S2O3標準溶液的體積，V2為空白試驗消耗Na2S2O3標準溶液的體積，C為Na2S2O3標準溶液的摩爾濃度，M為樣品質(zhì)量。

2結(jié)果與分析

2.1清除DPPH自由基的能力

從圖1可看出，4組多糖待測溶液中，清除DPPH自由基能力有所不同，其中混合多糖組最強，粗多糖組次之，脂溶性多糖組最弱。4組多糖待測溶液濃度發(fā)生變化時，其清除DPPH自由基的能力也發(fā)生相應(yīng)的變化，隨著待測組分中多糖濃度的逐漸升高，清除DPPH自由基的能力也逐漸增強。基于圖1中的數(shù)據(jù)，利用SPSS 15.0軟件對其進行方差分析，結(jié)果表明（表1），各組試驗數(shù)據(jù)之間的差異具有統(tǒng)計學意義，表明不同濃度的各組多糖對清除DPPH自由基能力有顯著差異，同時在一定范圍內(nèi)金櫻子多糖清除DPPH自由基能力隨著多糖濃度的升高而提高，呈現(xiàn)線性相關(guān)，其中混合多糖組回歸方程為y=0.144 3x+0497 3（R2=0.996 3），半清除率濃度EC50為0.018 7 mg/mL，對方程進行t檢驗，得出t=18.25>t0.001，4=7.173，可見回歸方程在0.001水平上顯著。

2.2·OH清除率

從圖2可看出，4組多糖待測溶液在清除·OH能力時，混合多糖組最強，水溶性多糖組次之，脂溶性多糖組最弱。同樣，當待測溶液中多糖濃度逐漸提高時，清除率也呈逐漸增加趨勢。利用SPSS 15.0軟件進行方差分析，結(jié)果表明（表2），各組試驗數(shù)據(jù)之間的差異具有統(tǒng)計學意義，不同濃度的多糖對·OH清除率有顯著差異；在試驗范圍內(nèi)，各組金櫻子多糖對·OH清除率都隨著多糖濃度的升高而增加。其中混合多糖組回歸方程為y=0084x+0.430 7（R2=0.992 0），半清除率濃度EC50為0.825 mg/mL，對方程進行t檢驗，t=12.14>t0.001，4=7.173，可見回歸方程在0.001水平上顯著。

2.3多糖在豬油中的抗氧化活性

從圖3可看出，4組多糖待測溶液在豬油中的抗氧化活性測試中，在試驗時間范圍內(nèi)，隨著時間的延長，脂溶性多糖組與PG抗氧化活性基本相同，表現(xiàn)出很強的抗氧化活性，混合多糖組次之，而水溶性多糖組最弱，與清除DPPH自由基及·OH試驗相比，各組活性測定結(jié)果有所不同。

3結(jié)論與討論

生物機體正常代謝過程中會產(chǎn)生超氧陰離子、·OH等活性氧自由基，在正常情況下，機體產(chǎn)生的過多自由基會迅速被體內(nèi)的清除劑所清除，因而機體自由基處于一種動態(tài)平衡之中。如果自由基過多能夠氧化體內(nèi)的生物膜、蛋白質(zhì)及核酸等，導(dǎo)致人體正常細胞和組織的損傷，從而引起多種疾病，加速機體的衰老進程，并誘發(fā)炎癥、惡性腫瘤、免疫失調(diào)等[14]。因此，研究能夠清除體內(nèi)活性氧自由基的天然抗氧化劑和食品有重要意義。很多研究表明，具有藥效作用的活性多糖在體外和體內(nèi)都具有較強的抗氧化活性，不同種類的

多糖化合物對不同反應(yīng)體系的抗氧化作用效果不同，對所清除的自由基種類也有選擇性[15]。

該試驗表明，金櫻子多糖具有良好的抗氧化活性，其中在清除DPPH自由基、·OH活性方面，混合多糖（水溶性、脂溶性多糖未分開）組最強，其中對·OH的半清除率濃度（EC50）為0.825 mg/mL，與已有報道接近[6]。豬油中的抗氧化活性測試中，脂溶性多糖組活性最強。研究證實，活性多糖大多為混合物，成分多樣，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其活性與多方面因素有關(guān)，尤其是多糖的一級結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)[16]。多糖傳統(tǒng)的提取方法有水提醇沉法、稀堿浸提法、稀酸浸提法和酶法等，分離多糖大都用多糖不溶于乙醇的特點而加入大量乙醇使之沉淀并析出水溶性多糖。該試驗除了收集水溶性多糖外，還對乙醇上清液中多糖進行了收集，該部分多糖實際溶解于70%左右的乙醇，應(yīng)該是極性小的一類多糖或多糖復(fù)合物，在POV試驗中表現(xiàn)出較強的活性。不同提取工藝所得的金櫻子多糖其分子結(jié)構(gòu)可能有一定的差異，分子結(jié)構(gòu)的差異決定了抗氧化活性的不同，該方面機制有待進一步深入研究。

安徽農(nóng)業(yè)科學2017年

參考文獻

[1] 王曉靜，張麗，陳莉華，等.湘西野生金櫻子多糖的抗氧化活性分析[J].藥物分析雜志，2016，36（3）：438- 443.

[2] 吳玉蘭，曹運長.中藥金櫻子的化學成分及其藥理作用研究進展[J].微量元素與健康研究，2012，29（1）：53-56.

[3] 吳興文，高品一，李玲芝，等.中藥金櫻子的化學成分研究[J].藥學實踐雜志，2009，27（3）：183-185.

[4] 林芳花，彭永宏，蔡爛光，等.金櫻子體外抗氧化提取工藝的研究[J].惠州學院學報（自然科學版），2010，30（3）：46-49.

[5] 皮建輝，胡朝暾，鄭晴，等.金櫻子多糖體外抗脂質(zhì)過氧化和紅細胞溶血作用研究[J].懷化學院學報，2012，31（5）：11-15.

[6] 韋玉蘭，蘇上貴，黃燕軍，等.金櫻子多糖抗氧化作用的實驗研究[J].廣西中醫(yī)藥，2015，38（3）：61-64.

[7] 李玲，孟英才，肖水平，等.金櫻子乙醇提取物抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2015，35（12）：14-17.

[8] 方積年，丁侃.天然藥物——多糖的主要生物活性及分離純化方法[J].中國天然藥物，2007，5（5）：338-347.

[9] 朱曉霞，羅學剛.多糖提取與純化技術(shù)應(yīng)用進展[J].食品研究與開發(fā)，2007，28（3）：186-189.

[10] 付學鵬，楊曉杰.蒲公英多糖的提取及含量測定[J].現(xiàn)代食品科技，2007，23（5）：37-39.

[11] 皮朝瓊，蔡珊蘭，真義才，等.金櫻子多糖對小鼠急性藥物肝損傷的保護作用[J].中國農(nóng)學通報，2012，28（35）：55-58.

[12] 彭金龍，毛健，黃桂東，等.黃酒多糖體外抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（20）：94-97.

[13] 陳曉麟，丁小雯.金櫻子提取液對豬油自動氧化作用的影響[J].重慶教育學院學報，2002，15（3）：53-55.

[14] MARITIM A C，SANDERS R A，WATKINS J B Ⅲ. Diabetes，oxidative stress，and antioxidants：A review[J]. J Biochem Mol Toxical，2003，17（1）：24-38.

[15] SHAO P，CHEN X X，SUN P L.Chemical characterization，antioxidant and antitumor activity of sulfated polysaccharide from Sargassum horneri[J].Carbohydrate polymers，2014，105（1）：260-269.

[16] HONDA S，AKAO E，SUZUKI S，et a1.Highperformance liquid chromatography of reducing carbohydrates as strongly ultravioletabsorbing and electrochemically sensitive 1phenyl3methyl5pyrazolone derivatives[J].Analytical biochemistry，1989，180（2）：351-357.