花生蛋白納豆菌發酵工藝條件的研究

用慧敏 唐君鈺 丁靖葦 鄒於岑 曹暉

摘要[目的]以花生粕作為納豆菌發酵主要原料，研究花生蛋白納豆菌發酵工藝的最佳條件。[方法]選擇合適的工藝流程，將納豆激酶活性和納豆菌活菌數作為觀察指標，通過單因素試驗和正交試驗對發酵條件進行優化。[結果]花生蛋白納豆菌發酵最佳工藝條件為接種量4%，發酵時間48 h，發酵溫度37 ℃，種齡18 h，初始pH 7.0。在上述發酵條件下，可得到較高的納豆激酶活力（271.57 U/mL）和納豆菌活菌數（36×105 cfu/mL）。[結論]該試驗結果為花生粕的研究與開發提供了理論依據。

關鍵詞花生粕；納豆菌；發酵；納豆激酶

中圖分類號S-3；TQ920.6文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）35-0070-05

Abstract[Objective] The optimum fermentation conditions of peanut protein of Bacillus natto were studied with peanut meal as the main raw material for the fermentation of Bacillus natto.[Method] We chose the proper process flow and selected the nattokinase activity and the viable count of Bacillus natto as the fermentation parameters to obtain the optimum conditions of fermentation of peanut protein of Bacillus natto，through the analysis of the single factor experiments and orthogonal experiment.[Result] The optimum fermentation conditions of peanut protein of Bacillus natto were as followed：the inoculum amount was 4%； the fermentation time was 48 h； the fermentation temperature was 37 ℃； the seed age was 18 h； and the initial pH was 7.0.Under the above fermentation conditions，higher activity of nattokinase （271.57 U/mL） and more live bacteria number of Bacillus natto （36×105 cfu/mL） could be obtained.[Conclusion] The results provide reference for research and development of peanut meal.

Key wordsPeanut meal；Bacillus natto；Fermentation；Nattokinase

花生粕是花生經高溫榨油后的副產物，含有豐富的花生蛋白，含量高達40%～55%，且氨基酸種類齊全，具有良好的營養價值。但因為高溫壓榨制油后，花生蛋白嚴重變性，從而使其主要被用作于飼料或肥料，但這2種方式對花生蛋白的利用率較低，易造成蛋白質資源浪費。若能對這些花生蛋白資源進行相關的研究利用，將極大地提高花生粕的附加值，從而帶來可觀的經濟效益。

20世紀初期，日本學者澤村發現并分離出了納豆菌[1]。納豆菌可以用來分解大分子物質，如分解蛋白質、碳水化合物、脂肪等，使發酵產物容易被機體所吸收[2] 。此外，在代謝過程中納豆菌可以產生納豆激酶[3-4]。納豆激酶是一種由納豆芽孢桿菌所產生的堿性絲氨酸蛋白酶。該酶具有很強的纖溶活性，能直接作用于纖維蛋白，也能激活體內纖溶酶原，且其具有安全性好、成本低、纖溶活性強、可口服、作用時間長等優點，正作為一個開發預防和治療血栓藥物的研究熱點[5-6]。 而且，納豆激酶具有調節血脂和防止動脈硬化的作用，對預防和治療高血壓也有重要意義。目前，已有較多的研究是關于利用枯草芽孢桿菌發酵豆粕來制備易消化的蛋白質飼料[7-9]，但利用其開展發酵花生粕的研究則很少，而納豆芽孢桿菌作為枯草芽孢桿菌的一個亞種，可將其用于進行花生粕發酵的研究。筆者以花生粕作為納豆菌發酵主要原料，以納豆激酶活性和納豆菌活菌數作為觀察指標，通過單因素試驗和正交試驗對花生蛋白納豆菌發酵工藝進行了優化。

1材料與方法

1.1材料

花生粕，納豆菌（揚州大學旅游烹飪學院分離保存），尿激酶標準品（西安依科生物技術有限公司），纖維蛋白原（北京達博諾科技有限公司），凝血酶（北京達博諾科技有限公司），瓊脂糖（北京雷利華康商貿有限公司），蛋白胨、牛肉膏、NaCl、瓊脂、胰蛋白胨、酵母膏、DDPH、無水乙醇、H2O2（揚州市廣陵區榮達儀器試劑經營部）。

1.2方法

1.2.1納豆激酶活力測定。采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法[10-11]。

1.2.1.1瓊脂糖-纖維蛋白平板的制作。

稱取200 mg瓊脂糖溶解于10 mL生理鹽水中，沸水浴中加熱30 min，取出室溫冷卻至50～55 ℃。稱取10 mg纖維蛋白原溶解于10 mL生理鹽水中（37 ℃水浴加熱）。將事先準備好的200 μL凝血酶（50 U/mL），加入瓊脂糖溶液中混勻，并快速倒入保溫好的纖維蛋白原溶液，混勻后立刻注入滅菌平板，注入時要避免出現氣泡，室溫靜置冷卻30 min，凝固后即為半透明的平板。用2 mm套管打孔，每個平板打孔4～6個。

1.2.1.2標準曲線的制作。

用配好的生理鹽水稀釋尿激酶標準品（1 500 U/支），配制成濃度為500.00、400.00、300.00、200.00、100.00、50.00 U/mL的尿激酶標準溶液。在平板上選定6個孔，將上述系列濃度尿激酶標準溶液分別以10 μL的量點在孔內，置于37 ℃恒溫箱中，保溫18 h。測量每個溶圈的直徑，計算溶圈面積。繪制標準曲線：以尿激酶標準品1 mL活性單位為橫坐標，以溶圈面積為縱坐標作圖。

1.2.1.3樣品的測定。

在平板上選定5個孔，每個孔依次加入10 μL樣品。置于37 ℃恒溫箱中保溫18 h。測量溶圈的直徑，計算溶圈的面積，通過標準曲線計算其活力。3點取平均值，樣品活力以“尿激酶活力單位”（UK）表示。

1.2.2納豆菌活菌數的測定[12]。

參考GB 4789.2—2010，食品衛生微生物學檢驗—菌落總數測定方法。將培養基換為營養瓊脂培養基。

1.2.3納豆菌的活化。

在無菌環境下，從納豆菌保藏斜面中取1環菌體劃線于牛肉膏蛋白胨斜面培養基中，置于37 ℃生化培養箱中培養36 h。

1.2.4納豆菌種子液的制備。

在無菌環境下挑取1環已經活化的納豆菌接入經高壓滅菌的置于250 mL三角瓶的200 mL LB液體培養基中，搖勻后在37 ℃生化培養箱中培養18 h。

1.2.5花生蛋白納豆菌發酵工藝流程。工藝流程見圖1。

1.2.6花生蛋白納豆菌發酵單因素試驗。

1.2.6.1種齡對花生蛋白納豆菌發酵的影響。

分別取培養12、15、18、21、24 h的納豆菌種子液，在發酵時間48 h、起始pH 7.0、發酵溫度37 ℃、接種量4%的發酵條件下進行5組發酵培養試驗，以納豆激酶活性和納豆菌活菌數為指標，確定適宜的種齡范圍。

1.2.6.2接種量對花生蛋白納豆菌發酵的影響。

按2%、3%、4%、5%、6%的接種量接種種子液，在發酵時間48 h、起始pH 7.0、發酵溫度37 ℃、種齡18 h的發酵條件下進行5組發酵培養試驗，以納豆激酶活性和納豆菌活菌數為指標，確定適宜的接種量范圍。

1.2.6.3初始pH對花生蛋白納豆菌發酵的影響。

將初始pH分別設定為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在發酵時間48 h、發酵溫度37 ℃、接種量4%、種齡18 h的發酵條件下進行5組發酵培養試驗，以納豆激酶活性和納豆菌活菌數為指標，確定適宜的初始pH。

1.2.6.4發酵吋間對花生蛋白納豆菌發酵的影響。

在起始pH 7.0、發酵溫度37 ℃、接種量4%、種齡18 h的發酵條件下，調整發酵時間分別為24、48、72、96、120 h，進行5組發酵培養試驗，以納豆激酶活性和納豆菌活菌數為指標，確定適宜的發酵時間范圍。

1.2.6.5發酵溫度對花生蛋白納豆菌發酵的影響。

將培養溫度分別設置為30、33、37、41、45 ℃進行發酵培養，在發酵時間48 h、起始pH 7.0、發酵溫度37 ℃、接種量4%、種齡18 h的發酵條件下進行5組發酵培養試驗，以納豆激酶活性和納豆菌活菌數為指標，確定適宜的培養溫度范圍。

1.2.7花生蛋白納豆菌發酵正交試驗。

從影響納豆激酶活性和納豆菌活菌數的一系列因素中篩選接種量、發酵時間、發酵溫度3個關鍵因素。結合單因素試驗設計，每個因素選取3個水平，根據正交試驗設計原理，設計3因素3水平的正交試驗。對正交試驗結果進行分析，確定最佳發酵條件。

2結果與分析

2.1瓊脂糖-纖維蛋白原平板法尿激酶標準曲線

當尿激酶活力在50～500 U/mL時，尿激酶活力與透明圈面積存在一定的線性關系。 直線回歸方程：y=0.006x+0.421 9，r2=0.960 2，線性相關性良好（圖2）。因此，可以通過測量發酵產物所形成的透明圈面積間接計算出納豆激酶相當于尿激酶的活力值。

2.2種齡對花生蛋白納豆菌發酵的影響

由圖3可知，當種齡在12～24 h時，納豆激酶活力的變化不明顯。當種齡在12～18 h時，隨著種齡的增大，納豆激酶活力呈緩慢上升趨勢；當種齡在18～24 h時，納豆激酶活力呈緩慢下降趨勢。種齡為18 h時納豆激酶活力達到最高。由圖4可知，當種齡在12～24 h時，納豆菌活菌數變化較大，當種齡為18 h時，納豆菌活菌數最大。一般情況下，接種的納豆菌種齡偏小，會出現前期生長緩慢，發酵周期延長，產物開始形成較慢的現象；接種的納豆菌種齡偏大，會造成生產能力下降，菌體過早自溶。選擇合適種齡的納豆菌種子液有利于納豆菌的生長和納豆激酶的形成。因此，選擇種齡為18 h。

2.3接種量對花生蛋白納豆菌發酵的影響

在發酵工業中通常采用增加接種量來縮短微生物的發酵周期，接種量越大，停滯期越短，發酵周期縮短，產物提前形成，但若接種量過多也不利于合成產物。由圖5可知，接種量對納豆激酶活力的影響較大，在其他發酵條件不變的情況下，當接種量為4%時納豆激酶的活力最大，接種量低于4%時酶活較低，這是因為菌體生長緩慢從而影響了正常代謝；接種量為4%～6%時，隨著接種量的增多納豆激酶的活力呈下降趨勢。接種量過低時菌體的生長變慢，會影響正常的代謝；接種量過高時，會出現納豆菌活菌迅速死亡的現象。由圖6可知，不同的接種量對納豆菌活菌數存在差異，在其他發酵條件不變的情況下，當接種量過小時，納豆菌活菌數較少。

2.4初始pH對花生蛋白納豆菌發酵的影響

由于在發酵過程中發酵產物的pH會發生變化，所以要選擇適宜的初始pH，最大程度地有利于納豆激酶的形成。由圖7可知，當pH為7.0時最有利于納豆激酶的形成，因此適宜的初始pH是7.0。

由圖8可知，納豆菌生長的最適初始 pH 在7.0左右。試驗結果表明，當初始pH為5.0～7.0時，納豆菌活菌數呈上升趨勢，當初始pH大于7.0時，活菌數開始下降。

2.5發酵時間對花生蛋白納豆菌發酵的影響

納豆菌的發酵時間過短或過長都會對菌體的生長產生影響。由圖9可知，發酵時間在24～72 h時，隨著發酵時間的延長納豆激酶的活力逐漸增強，發酵時間超過72 h后納豆激酶的活力開始下降。納豆激酶活力在72 h時達到最高。由圖10可知，發酵時間過長時，納豆菌活菌數會有所減少。

2.6發酵溫度對花生蛋白納豆菌發酵的影響由圖11可知，不同發酵溫度對納豆激酶活力存在一定的影響。在發酵溫度為37 ℃時納豆激酶的活力較高，當溫度為45 ℃時納豆激酶的活力非常低，這可能是由于過高的溫度抑制了納豆菌的生長。一般情況下，溫度越高，反應速度越快，微生物的生長和代謝速度會加快，但同時由于酶對溫度的熱敏性較強，溫度越高越容易使其失活，影響其發酵產量，所以在微生物的生長發酵過程中應注意控制反應溫度，在保證其活性的同時提高其生長和代謝速度、增加酶產量。適當降低溫度將有利于納豆菌的生長及產酶。

由圖12可知，不同發酵溫度對納豆菌的生長存在一定的影響。在發酵溫度較低時，菌體代謝緩慢，不利于其生長；發酵溫度過高時，菌體在開始的短時間內就大量生長，快速消耗營養物質，穩定期維持時間較短，很快就會進入衰亡期，活菌數會開始減少。

2.7花生蛋白納豆菌發酵工藝正交試驗結果

根據表1正交試驗因素與水平，進行3因素3水平的正交試驗，正交試驗結果見表 2。

由表2可知，RC>RB>RA，可見各因素對納豆激酶活性影響從大到小的順序為C、B、A，比較各因素k 值，得到3個因素的最優組合為A2B1C2，即接種量為 4%，發酵時間為48 h，發酵溫度為37 ℃。由于所得到最優組合已出現在上述正交試驗中的9組試驗中，并通過與其他8組試驗進行比較，發現納豆激酶活性最高，實現正交目的，無需再進行追加試驗。

由表2可知，R′C>R′B>R′A，可見各因素對納豆菌活菌數影響從大到小的順序為C、B、A，比較各因素k′值，得到3個因素的最優組合為A2B1C2，即接種量為 4%，發酵時間為48 h，發酵溫度為37 ℃。由于所得最優組合已出現在上述正交試驗中的9組試驗中，并通過與其他8組試驗進行比較，可觀察到納豆菌活菌數達到最大，實現正交目的，無需再進行追加試驗。

綜合2個指標得出，納豆菌發酵花生粕最佳工藝條件為接種量4%，發酵時間48 h，發酵溫度37 ℃。

對納豆菌發酵花生粕正交試驗表進行方差分析，結果表明，發酵時間對納豆激酶活力影響較大，而發酵溫度和接種量對其影響較小。3個因素的主次順序為發酵溫度、發酵時間、接種量。

對納豆菌活菌數的方差分析表明，發酵溫度對納豆菌活菌數具有顯著影響，而接種量和發酵時間對其影響較小。3個因素的主次順序為發酵溫度、發酵時間、接種量。

綜合2個指標得出，納豆菌發酵花生粕工藝的最佳條件是接種量為 4%，發酵時間為48 h，發酵溫度為37 ℃。

3結論

主要以納豆激酶活性、納豆菌活菌數為指標，通過單因素試驗和正交試驗對花生蛋白納豆菌發酵工藝條件進行優化。單因素試驗發現選擇合適種齡的納豆菌種子液有利于納豆菌的生長和納豆激酶的形成。試驗結果表明，應選擇種齡為18 h。接種量對納豆激酶活力和納豆菌活菌數存在一定的影響，在其他發酵條件不變的情況下，接種量過低時菌體的生長變慢，會影響正常的代謝；接種量過高時，會出現納豆菌活菌迅速死亡的現象。為保證納豆激酶活力、活菌數為最佳，應選擇初始pH為7.0。納豆菌的發酵時間過短或過長都會對菌體的生長產生影響。當發酵時間為72 h時納豆激酶活力達到最高，納豆菌活菌數達到最大。適當降低溫度將有利于納豆菌的生長及產酶。

通過正交試驗得出納豆菌發酵花生粕對納豆激酶活性的影響從大到小順序為發酵溫度、發酵時間、接種量，最優組合為接種量4%，發酵時間48 h，發酵溫度37 ℃。納豆菌發酵花生粕對納豆菌活菌數的影響從大到小順序為發酵溫度、發酵時間、接種量，最優組合為接種量4%，發酵時間48 h，發酵溫度37 ℃。綜合2個指標得出，納豆菌發酵花生粕工藝的最佳條件為接種量4%，發酵時間48 h，發酵溫度37 ℃。

在接種量為 4%、發酵時間為48 h、發酵溫度為37 ℃、種齡為18 h、初始pH為7.0的最佳發酵條件下，納豆激酶的活力為271.57 U/mL，納豆菌活菌數為36×105 cfu/mL。

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