羅漢果祛痰作用譜效關系研究

王勤 肖喜泉 董威 唐慧勤 盧鳳來 李耀華 李典鵬 王劍 林吳

摘要： 為了研究羅漢果祛痰作用與活性成分的相關性，該研究首先測定了19批羅漢果提取物高效液相（HPLC）指紋圖譜和小鼠氣管酚紅排泌量，找出了指紋圖譜共有峰，采用灰色關聯度法確定各共有峰對祛痰效果貢獻度，利用偏最小二乘法（PLS）得出了各共有峰的正負相關及貢獻度。結果表明：共有峰為14個，其中關聯度在0.8以上的有12個峰（正相關峰為3、11、12、13號峰，負相關峰為1、2、4-10、14號峰）；11、12號峰分別為氧化羅漢果苷Ⅴ和羅漢果苷Ⅴ。因此，羅漢果祛痰作用不是單一成分起作用，而是多種成分綜合作用的結果。其中，氧化羅漢果苷Ⅴ和羅漢果苷Ⅴ有祛痰作用，貢獻率較大。

關鍵詞： 羅漢果， 祛痰作用， 譜效關系

中圖分類號： Q946

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）05060604

Abstract： In order to investigate the relationship between expectorant efficacy and active components of Siraitia grosvenorii， the phenol red secretion of trachea in mice and the HPLC fingerprint of S. grosvenorii extract were determined. Grey relational analysis was applied to confirm the contribution degree of each common peak from HPLC fingerprints for expectoration efficacy， while partial leastsquares regression （PLS） was utilized to confirm either positive or negative relationship， and to identify the contribution degree of S. grosvenorii extract. The results indicated that fourteen common peaks were chosen in HPLC fingerprints， including twelve peaks with relation rate higher than 0.8 （No.3， 11， 12， 13 peaks were positive correlation peaks， and No.1， 2， 4-10， 14 peaks were negative correlation peaks）， No.11 and 12 peaks were Oxomogroside V and Mogroside V respectively. Therefore， expectorant efficacy of S. grosvenorii is contributed by a combined action of multicomponents rather than one component. Oxomogroside V and Mogroside V have an expectorant efficacy and high contribution degree.

Key words： Siraitia grosvenorii， expectorant efficacy， spectrumefficacy relationship

羅漢果（ Siraitia grosvenorii） 是廣西道地中藥材，具有止咳、祛痰、通便、解痙、保肝（王勤等，1999； 張宏等，2011）、抗病毒、抗腫瘤、抗疲勞（夏星等，2012； 何超文等，2012b） 等廣泛的藥理活性。而與藥理作用相關的活性成分大多指向羅漢果甜苷Ⅴ（王霆等，1999；劉婷等，2007），其他化學成分對藥理作用是否有貢獻，尚不明確。

2015年版《中華人民共和國藥典》中羅漢果的評價標準有定性鑒別及規定羅漢果皂苷Ⅴ的含量測定不得少于0.50%（國家藥典委員會，2015）。現行的羅漢果質量標準對保障羅漢果的基本質量起了肯定的作用，但它忽略了中藥的藥效是多成分的協同作用，難以對其質量進行較全面的評價。而中藥譜效關系是將中藥的藥效與指紋圖譜很好地結合起來評價中藥內在質量及其成分與其活性間關系的新方法（國家中醫藥管理局中華本草編委會，1999）。本研究通過建立羅漢果指紋圖譜獲得化學數據，同時采用小鼠酚紅排泌法獲得祛痰藥效數據，運用灰度關聯法與最小偏二乘法將化學數據與藥效數據相關聯，建立羅漢果祛痰的譜效關系模型。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑羅漢果藥材19批，均為青皮果，經廣西中醫藥大學藥物鑒定教研室田慧教授鑒定為羅漢果（Momordica grosvenori）的果實。藥材編號及產地：永福龍江（S1-11，育苗方式、采摘時間、果形大小等有差異，下同）、湖南衡陽（S12-13）、南寧壇洛（S14-15）、永福堡里（S16-17）、永福百壽（S18-19）。對照品羅漢果苷Ⅴ為本實驗小組自制，遠志購自柳州市神農中藥飲片廠，批號20130305。酚紅，國藥集團化學試劑有限公司，批號20130725。碳酸氫鈉，成都市科龍化工試劑廠，批號：20130409。氫氧化鈉，成都市科龍化工試劑廠，批號：2013102101。分析純甲醇、乙醇、磷酸，廣東汕頭市西隴化工廠。色譜純乙腈，美國TEDIA公司。水為重蒸蒸餾水，自制。

1.1.2 儀器1100分析型高效液相色譜儀（包括二極管列陣多波長DVD檢測器、四元梯度泵、在線真空脫氣機、7725i手動進樣器、HP化學工作站），美國Agilent公司；B3500SMT超聲波清洗器，必能信超聲（上海）有限公司；雙光束紫外可見光光度計TU1901，北京普析通用儀器有限公司；L600臺式低速自動平衡離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；MATLAB R2013數學軟件，美國MathWorks公司。

1.1.3 動物昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～24 g，廣西醫科大學實驗動物中心提供。合格證號： SCXK桂2009-0002。

1.2 方法

1.2.1 羅漢果提取物制備稱取羅漢果藥材1 000 g，先后用10倍量、8倍量、5倍量的水提取，時間分別為1.5、1、1 h，合并濾液，加熱濃縮至1 000 mL，加入1倍量的95%乙醇，混勻，封口，-4 ℃靜置48 h，抽濾，得濾液回收乙醇濃縮成浸膏備用。

1.2.2 小鼠氣管酚紅法420只小鼠，雌雄各半，隨機分為19個羅漢果組、空白組與陽性遠志組，每組20只。Ig分別給予羅漢果提取物每公斤40 g生藥量（每公斤體重給羅漢果藥材量），純凈水與遠志提取物20 g·kg1（每公斤體重給遠志藥材量），給藥體積為0.2 mL·10 g1，每天給藥1次，連續給藥3 d。第2天給藥后禁食不禁水10 h。末次給藥45 min后腹腔注射0.5%酚紅溶液0.5 mL，15 min后悶死，用5% NaHCO3溶液1 mL灌洗呼吸道，重復3次，合并洗出液，離心，取上清液用紫外分光光度計（波長546 nm）比色。通過酚紅溶液濃度標準曲線，計算酚紅排泌量以及祛痰率。

祛痰率=（實驗組平均酚紅排泌量-空白組酚紅排泌量）/ 空白組酚紅排泌量

表1結果顯示，遠志組和19個羅漢果組對小鼠均有一定的祛痰作用。因此，對19批羅漢果提取物進行小鼠祛痰作用的譜效關系研究。

1.2.3 羅漢果提取物的HPLC指紋圖譜

1.2.3.1 色譜條件色譜柱：ZORBAXSBC18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：20 ℃；流動相：0.05%磷酸（A）- 乙腈（B）（梯度洗脫：0～8 min，3%～13.5% B；8～35 min，13.5%～35%B；35～45 min：35% B）；檢測時間：45 min；流速：0.8 mL·min1；檢測波長：203 nm；進樣量：10 μL（盧風來等，2010）。

1.2.3.2 對照品溶液制備稱取羅漢果苷Ⅴ、氧化羅漢果苷Ⅴ適量，用甲醇溶解到5 mL的容量瓶中，超聲使其充分溶解，并用甲醇定容至刻度，以0.45 μm的微孔濾膜濾過，濾液作為對照品溶液。

1.2.3.3 供試品溶液制備取羅漢果浸膏2 g，精密稱量，置25 mL容量瓶中，加入純凈水定容至刻度，溶解，搖勻，以0.45 μm的微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

1.2.3.4 HPLC圖譜峰的歸屬精密吸取羅漢果苷Ⅴ及氧化羅漢果苷Ⅴ對照品溶液以及19批羅漢果供試藥品溶液進樣，按“2.3.1”項下色譜條件測定。19批羅漢果共確定有14個共有峰，其中11號和12號峰分別與對照品氧化羅漢果苷Ⅴ和羅漢果苷Ⅴ的保留時間與紫外光譜圖相同，鑒定為氧化羅漢果苷Ⅴ和羅漢果苷Ⅴ（圖1）。

2結果與分析

2.1 譜效關系的灰色關聯度和關聯順序分析

將各共有峰原始數據進行標準化轉換（即首先分別求出各個序列數據的平均值，再用平均值去除以對應序列中的各個原始數據，所得到的商為新的數據列，即均值化數列，又叫規格化數據）。根據灰色關聯度分析法計算關聯度，結果見表2。

從表2可以看出，各個共有峰所代表的化學成分與祛痰作用均具有一定的關聯（關聯度>0.60），表明羅漢果提取物的祛痰作用是其多個化學成分共同作用的結果。在羅漢果提取物HPLC指紋圖譜中，1-4號峰、6號峰以及8-14號峰所代表的化學成分與祛痰作用具有高度關聯（關聯度>0.80）。依據關聯度的大小，確定各成分（P）對祛痰作用貢獻大小順序為P11>P12>P1>P14>P8>P3>P13>P9>P6>P2>P4>P10>P7>P5。其中11號峰為氧化羅漢果苷Ⅴ，12號峰為羅漢果苷Ⅴ。

2.2 譜效關系的偏最小二乘法分析

使用MATLAB R2013軟件，依據偏最小二乘分析方法，計算出上述指紋圖譜中各個共有峰的峰面積與祛痰藥效間的數理關系。表2結果表明，根據19批羅漢果提取物的圖譜數據，得出各峰（P）對祛痰作用的貢獻大小依次為P12>P11>P13>P3>P4>P10>P8>P7>P1>P2>P9>P14>P5>P6，其中P12、P11、P13、P3與祛痰效果呈正相關，P4、P10、P8、P7、P1、P2、P9、P14、P5、P6與祛痰效果呈負相關。

3討論與結論

本研究使用經典的酚紅排泌法來測定不同產地、不同采收期、不同加工方法的羅漢果共19批次的祛痰作用，結果羅漢果的祛痰作用明顯。同時使用HPLC建立了羅漢果提取物的指紋圖譜，發現了其中14個共有特征峰，并確定了其中2個指紋峰，分別為羅漢果苷Ⅴ與氧化羅漢果苷Ⅴ。用灰色關聯度法進行譜效關系分析，結果表明在HPLC指紋圖譜中，P11、P12、P1、P14、P8與祛痰作用的關聯度較大，其中P11為氧化羅漢果苷Ⅴ，P12為羅漢果苷Ⅴ。王霆等（1999）報道羅漢果甜苷有祛痰作用，劉婷等（2007）也報道羅漢果皂苷Ⅴ有祛痰作用。本研究使用偏最小二乘法分析譜效關系，結果表明P12、P11、P13與祛痰作用呈正相關且貢獻較大，P1、P14、P8則呈負相關，提示羅漢果提取物的祛痰作用可能是多種成分共同作用的結果，這與我們的預期相符。而羅漢果苷Ⅴ是羅漢果甜苷主要組成成分之一，本研究結果提示羅漢果苷Ⅴ對祛痰作用的貢獻率較大，與王霆等（1999）和劉婷等（2007）的研究結果相吻合。

本研究中，由于通過質譜技術和對照品等因素，除了P11和P12外，其他峰是何化學成分還無法鑒定。而將這些化合成分分離出來，采用波譜技術進行鑒定，并測定其藥理活性，將是本課題今后的研究方向之一。

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