前列通片促進(jìn)免疫功能的實(shí)驗(yàn)研究

尹震 吳燕梅 吳鋼

摘要 目的：探討前列通片對(duì)小鼠免疫功能的影響。方法：1）脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：將60只小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、前列通片低、中、高劑量組，每組12只。灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥30 d后各組動(dòng)物無(wú)菌取脾，提取脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。2）NK細(xì)胞活性影響試驗(yàn)：將60只小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、前列通片低、中、高劑量組。除陰性對(duì)照組外，其余各組腹腔注射環(huán)磷酰胺建立免疫功能低下的小鼠模型。造模同時(shí)給藥，連續(xù)給藥30 d后，各組動(dòng)物無(wú)菌取脾，提取脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行NK細(xì)胞活性影響試驗(yàn)。結(jié)果：1）與陰性對(duì)照組比較，前列通片高劑量組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2）與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及前列通片高劑量組NK細(xì)胞活性顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：在本實(shí)驗(yàn)條件下，前列通片能夠提高機(jī)體淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力以及NK細(xì)胞的活性，具有一定的免疫促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞 前列通片；免疫調(diào)節(jié)；淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力；NK細(xì)胞的活性

Abstract Objective： To study the effect of Qianlietong Tablets in regulating immune function on mice. Methods： 1） Splenic Lymphocyte transformation test： A total of 60 SPF grade BALB/c mice were randomly divided into negative control group， positive control group， and Qianlietong Tablets low-， medium-， and high-dose groups. After Intragastric administration of different medications for different groups for 30 days continuously， spleens of each group were obtained in aseptic condition. Then spleen lymphocytes were extracted for transformation test. 2） NK cell activity effect test： A total of 60 SPF grade BALB/c mice were randomly divided into negative control group， model group， positive control group and Qianlietong Tablets low-， medium-， and high-dose groups. Except the negative group， mice model with low immune function was built in other groups by intraperitoneal injection of cyclophosphamide， and the mice models were given medicines as well. After 30 days of medication， spleens were obtained in aseptic condition. Spleen lymphocytes were extracted for testing influence on NK cell activity. Results： 1） Compared with the negative control group， the spleen lymphocytes transformation ability of the Qianlietong Tablets high-dose group increased obviously with significant difference（P<0.05）. 2） Compared with the model group， the NK cell activity of the positive control group and the Qianlietong Tablets high-dose group increased obviously with statistical difference （P<0.05）. Conclusion： Under the experimental condition， Qianlietong Tablets can improve lymphocytes transformation ability and NK cell activity， which proves that Qianlietong Tablets has the effect of promoting immune function.

Key Words Qianlietong Tablets； Immune Regulation； Lymphocyte Transformation； NK cell activity

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.06.047

隨著中藥研究的拓展，中藥在機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)方面的作用越來(lái)越受到重視。目前已有研究證實(shí)中藥具有免疫促進(jìn)和免疫抑制的雙向免疫調(diào)節(jié)作用[1]。羅夏等研究表明復(fù)方中藥能夠提高實(shí)驗(yàn)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，增加巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)，提高機(jī)體免疫力[2]。施軍等[3]的研究證實(shí)甘草提取物甘草甜素可明顯抑制二硝基氟苯誘發(fā)的小鼠接觸性超敏反應(yīng)。

前列通片主要由廣東王不留行、黃芪、車(chē)前子、關(guān)黃柏、兩頭尖、蒲公英、澤蘭、琥珀、八角茴香油、肉桂油等組成，具有清利濕濁，化瘀散結(jié)的功能，現(xiàn)代藥理研究表明，其具有抑制前列腺增生、消炎鎮(zhèn)痛、活血祛瘀的作用[4-5]，臨床上主要用于治療前列腺炎及前列腺增生。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，慢性前列腺炎的發(fā)病與患者自身免疫能力有一定聯(lián)系，患者發(fā)病后會(huì)伴有免疫功能的改變，而局部免疫功能異常正是導(dǎo)致患者病情反復(fù)的主要原因[6]。本研究通過(guò)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)及NK細(xì)胞活性試驗(yàn)，初步探討前列通片的免疫調(diào)節(jié)活性，為前列通片免疫調(diào)節(jié)活性的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 1）SPF級(jí)BALB/c小鼠，132只，雄性；體重范圍：18.7～22.9 g；由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2）動(dòng)物飼養(yǎng)條件：群養(yǎng)，3只/箱，飼養(yǎng)溫度與濕度：20.6～22.8 ℃，44.9%～69.8%，采用10 h：14 h晝夜間斷照明；飼養(yǎng)室條件始終保持穩(wěn)定，以保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。試驗(yàn)期間動(dòng)物均按實(shí)驗(yàn)要求喂以相應(yīng)顆粒飼料，所有飼料均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物自由進(jìn)食飲水。

1.1.2 藥物 1）轉(zhuǎn)移因子口服液（批號(hào)：150506、150901、150902），由南京瑞爾醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)。2）前列通片（廣州白云山中一藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：V00028）。

1.1.3 試劑與儀器 1）實(shí)驗(yàn)用溶媒或乳化劑：0.5% CMC-Na溶液：量取4/5總配制量的純凈水至燒杯中，準(zhǔn)確稱(chēng)取適量羧甲基纖維素鈉，磁力攪拌器邊加熱邊攪拌下緩慢加入燒杯中，攪拌至完全溶解，4～8 ℃冰箱放置過(guò)夜，第2天定容至所需量即可；純凈水。2）主要實(shí)驗(yàn)儀器：BS224S電子天平：感量：0.0001 g，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）科技有限公司；KDC-2046低速冷凍離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)：蘇州凈化有限公司；CKX41倒置顯微鏡：日本奧林巴斯公司；311型二氧化碳培養(yǎng)箱：Thermo；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技公司；LMQ.C全自動(dòng)滅菌器：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；DHG-9245A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司。3）主要試劑：刀豆蛋白A（ConA），批號(hào)：SLBK7858V，Sigma公司；MTT，批號(hào)：M7905，MP Biomedicals，LLC；濃鹽酸：批號(hào)：20141005-1，廣州化學(xué)試劑廠；異丙醇，批號(hào)：150812，廣州市中南化學(xué)試劑有限公司；Triton X-100，批號(hào)：MR29539，MP Biomedicals，LLC；PBS，批號(hào)：10B16B30，博士德生物工程有限公司；Tris base，批號(hào)：20121223，MBCHEM；乳酸鋰，批號(hào)：P1076996，Adamas Reagent Co.，Ltd；

1.2 方法

1.2.1 脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) SPF級(jí)BALB/c小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、前列通片低、中、高劑量組，12只/組。陽(yáng)性組按20 mL/kg的劑量灌胃給予轉(zhuǎn)移因子口服液，陰性對(duì)照組灌胃給予0.5% CMC-Na溶液，前列通片低、中、高劑量組按1.02 g/kg、2.04 g/kg、4.08 g/kg的劑量灌胃給予前列通片，1次/d，連續(xù)30 d。末次給藥24 h后，各組動(dòng)物無(wú)菌取脾，配制脾淋巴細(xì)胞懸液。將每份脾細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，一孔加50 μL ConA液，另一孔加入50 μL培養(yǎng)液作對(duì)照。置5%CO2，37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入5 mg/mL MTT 50 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，然后分裝至96孔板中，每孔作3個(gè)平行孔，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)定吸光度，然后計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖能力，淋巴細(xì)胞增殖能力=Con A孔吸光度值-無(wú)Con A孔吸光度值。

1.2.2 NK細(xì)胞活性影響試驗(yàn) SPF級(jí)BALB/c小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、前列通片低、中、高劑量組，12只/組。除陰性對(duì)照組外，其余各組按60 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)3 d，之后，在第15天、第26天分別按40、50 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺建立免疫功能低下的小鼠模型。造模同時(shí)給藥，各給藥組給藥劑量及方法與脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)相同，陰性對(duì)照組及模型組灌胃給予0.5%CMC-Na溶液，1次/d，連續(xù)30 d。末次給藥24 h后，各組動(dòng)物無(wú)菌取脾，配制脾淋巴細(xì)胞懸液。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100 μL（效靶比50：1），加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中；靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL；靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和2.5%Triton各100 μL；上述各項(xiàng)均設(shè)3個(gè)平行孔，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，然后將96孔培養(yǎng)板以1 500 r/min離心5 min，每孔吸取上清100 μL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100 μL，反應(yīng)6 min，每孔加入1 mol/L的HCL 30 μL，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定光密度值（OD），并計(jì)算NK細(xì)胞活性。

NK細(xì)胞活性（%）=反應(yīng)孔OD-自然釋放孔OD最大釋放孔OD-自然釋放孔OD×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用（±s）表示，應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)量資料數(shù)據(jù)方差齊，或數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后方差齊，則采用單因素方差分析；若數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后方差仍不齊，采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 與陰性對(duì)照組比較，前列通片高劑量組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 NK細(xì)胞活性影響試驗(yàn) 與陰性對(duì)照組比較，模型組NK細(xì)胞活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及前列通片高劑量組NK細(xì)胞活性顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

淋巴細(xì)胞的增殖和分化是機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中的一個(gè)重要階段，淋巴細(xì)胞受到抗原或促有絲分裂原刺激時(shí)增殖能力的強(qiáng)弱反映了淋巴細(xì)胞功能的高低，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是細(xì)胞免疫功能評(píng)價(jià)的常用體外試驗(yàn)方法。NK細(xì)胞主要存在于外周血和脾中，不依賴(lài)抗體也不需要抗原刺激和致敏就能殺傷靶細(xì)胞，NK細(xì)胞的活性可反映機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答功能的強(qiáng)弱[7]。因此本研究通過(guò)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)及對(duì)NK細(xì)胞活性的影響來(lái)評(píng)價(jià)前列通片對(duì)正常小鼠免疫功能的影響。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸主要與正虛邪盛有關(guān)，正虛則抵抗力差，這與免疫低下密切相關(guān)，中醫(yī)采用扶正祛邪治療法則，取得良好療效，發(fā)現(xiàn)不少補(bǔ)益類(lèi)和清熱解毒類(lèi)中藥具有免疫促進(jìn)作用[8]。前列通片主要由廣東王不留行、黃芪、車(chē)前子、關(guān)黃柏、兩頭尖、蒲公英、澤蘭、琥珀、八角茴香油、肉桂油等組成。其中，廣東王不留行為桑科榕屬植物薜荔Ficus pumila L.的干燥花序托，主要含有三萜、黃酮、倍半萜等化合物，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、增強(qiáng)免疫等作用[9]；黃芪為最常用的“扶正固本，補(bǔ)中益氣”中藥之一，其主要成分包括多糖、黃酮、苷類(lèi)等化合物，其中，黃芪多糖與黃芪總苷具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用[10]；車(chē)前子主要有多糖、苯乙醇苷等化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理研究表明其在免疫調(diào)節(jié)方面有一定的活性[11]；此外，蒲公英多糖、八角茴香油提取液等均具有免疫功能促進(jìn)作用[12-13]。以上，為前列通片促進(jìn)免疫功能的發(fā)揮奠定了一定的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)研究證實(shí)前列通片能夠提高機(jī)體淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力以及NK細(xì)胞的活性，具有一定的促進(jìn)免疫功能的作用，但關(guān)于其發(fā)揮免疫促進(jìn)功能的主要成分有待進(jìn)一步探討。

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（2017-04-10收稿 責(zé)任編輯：徐穎）