千斤拔多糖對小鼠免疫功能的調節作用

卓燊 喬雪 楊子明 陸玉婷 秦海洸1213《廣西植物》征訂啟事

摘要： 為研究千斤拔多糖對正常及免疫低下小鼠免疫功能的調節作用，該研究選用SPF級BALB/c小鼠，免疫抑制小鼠采用隔天皮下注射環磷酰胺（40 mg·kg1）5次，通過測定脾臟、胸腺質量及計算臟器指數，采用碳粒廓清法計算單核巨噬細胞吞噬功能，在雞紅細胞免疫后測定小鼠血清溶血素抗體水平，同時觀察高、低劑量千斤拔多糖（劑量分別為500、1 000 kg·d1）對正常小鼠及免疫低下小鼠免疫調節的影響。結果表明：千斤拔多糖高、低劑量組對正常及免疫低下小鼠均有不同程度的增加脾臟指數、胸腺指數的作用；千斤拔多糖高、低劑量組對正常及免疫低下小鼠均能提高廓清指數，但沒有統計學意義；千斤拔多糖高劑量組對正常及免疫低下小鼠的血清溶血素抗體水平都有顯著性提高。這說明千斤拔多糖能有效提高正常及免疫低下小鼠免疫功能的作用。

關鍵詞： 千斤拔， 多糖， 環磷酰胺， 免疫低下， 免疫調節

中圖分類號： Q946.3， R285.5文獻標識碼： A文章編號： 10003142（2017）09121306

Abstract： To study the immunoregulatory activity of Flemingia polysaccharide on immuno compromised by cyclophosphamide and normal mice. We measured thymus， spleen and calculated the visceral index； measured mononuclearmacrophage phagocytic function by the Carbon Grain Kuo Clear Law； measured the level of serum hemolysin after erythrocyte immune， to observe the effect of the high and low dose of Flemingia polysaccharide（doses of 500， 1 000 kg·d1） on the normal SPF BALB/c mice. We injected cyclophosphamide （40 mg·kg1） five times subcutaneously every other day to lead to the immunosuppression mice. We measured thymus， spleen and calculated the visceral index； measured mononuclearmacrophage phagocytic function by the Carbon Grain Kuo Clear Law； measured the level of serum hemolysin after erythrocyte immune， observe the effect of the high and low dose of Flemingia polysaccharide on the immunocompromised SPF BALB/c mice. High and low dose of Flemingia polysaccharide could increase index of immune organs， carbon clearance capacity in varying degress（P<0.05 or P<0.01）， and could also enhance the clearance index on normal and immunocompromised mice， but it have no significance， and could increase antibody of serum hemolysin significantly （P<0.05 or P<0.01） as well. These indicate that Flemingia polysaccharide can obviously enhance the immune function in normal and immuno compromised mice.

Key words： Flemingia， polysaccharide， cyclophosphamide， immunocompromised， immunoregulatory

千斤拔為豆科植物繡毛千斤拔（Flemingia ferruginea），大葉千斤拔（F. macrophylla） 或蔓性千斤拔（F. philippinensis）的干燥根，主要分布于華南、華中、西南等地，為廣西道地藥材，是廣西少數民族壯族及瑤族常用藥材（韋裕宗，1991）。千斤拔廣泛用于治療腰肌勞損、陽痿、遺精、風濕痹痛、腰腿痛、風濕關節炎、婦科病、乳房疾病等病痛（吳征鎰，1991）。在前期的研究中，千斤拔水煎劑對正常小鼠的脾臟指數、胸腺指數、單核巨噬細胞吞噬功能、血清溶血素抗體生成均具有增強的作用，表明千斤拔水煎劑具有較好的增強小鼠免疫力作用（卓燊等，2014）。隨著多糖研究的深入，多糖的多種生物活性被發現，如抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗輻射、抗凝血、保肝降酶、保濕、降血糖、免疫調節等（薛丹等，2014；Schepetkin & Quinn， 2006；Tao & Tian， 2006；Ge et al， 2009）。

近年來，崔倩倩等（2015）的研究結果證實了植物多糖能夠激活免疫系統發揮免疫調節作用。有文獻報道，赤雹果多糖有顯著提高免疫抑制小鼠免疫功能的作用（趙波等，2010）。杜仲葉多糖能在一定程度上提高小鼠腹腔巨噬細胞的廓清能力、吞噬速度及血清中溶血素的含量，提高胸腺和脾臟系數，提高小鼠機體免疫能力（葉穎霞等，2015）。鑒于前期發現千斤拔具有提高免疫力的作用，那么千斤拔多糖是否是千斤拔提高免疫力的有效成分？對此開展進一步的研究。因此，本文主要研究了不同劑量的千斤拔多糖對正常小鼠及免疫抑制低下小鼠免疫功能的作用。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物BALB/C小鼠，體重18～22 g，SPF級，購置湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（湘）2009-0004。

1.1.2 儀器TGL16R型高速臺式離心機（珠海黑馬公司），METTLERAT200電子天平（梅特樂-托利多儀器上海有限公司），RT9100型半自動生化分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）。

1.1.3 藥物千斤拔，購自廣西玉林藥材市場[經廣西中醫藥大學劉壽養教授鑒定為寬葉千斤拔（Flemingia latifolia）]；印度墨汁（批號：20140706），青島海博生物；環磷酰胺（批號： 20140706），SIGMA公司。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備環磷酰胺注射液：用生理鹽水配制4 mg·mL1的環磷酰胺注射液，現用現配。

5%雞紅細胞懸液：取健康雞的全血于抗凝試管中，于1 000 r·min1離心10 min，棄去上清液，用生理鹽水洗滌紅細胞2～3次。取0.5 mL雞紅細胞用生理鹽水定容至10 mL，即得5%雞紅細胞懸液。

補體：市售健康豚鼠，動脈取血，4 000 r·min1離心10 min，取血清，用生理鹽水配制成10%的豚鼠血清溶液，待用。墨水：印度墨汁用生理鹽水稀釋5倍，于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 千斤拔多糖的制備取千斤拔干燥藥材，用10倍體積的蒸餾水浸泡1 h，加熱煮沸2.5 h，趁熱過濾，殘渣再加6倍體積的蒸餾水，加熱煮沸1 h，合并2次濾液，濃縮至原體積的1/10備用，采用sevag法脫蛋白，加入25 mL Sevage試劑（氯仿與正丁醇體積比為4∶1），萃取3次，加入兩倍體積的無水乙醇，棄上清液，濃縮，冷凍干燥備用，測其多糖純度為78%。用此千斤拔多糖干燥品用蒸餾水配制成25、50 mg·mL1。

1.2.3 實驗設計

1.2.3.1 正常小鼠免疫器官重量的測定小鼠30只，隨機分為3組（每組10只）：正常組、千斤拔多糖低劑量組（500 mg·kg1）、千斤拔多糖高劑量組（1 000 mg·kg1）。連續灌胃給藥21 d（正常組和模型組給予等體積水），禁食24 h，稱體重，脫頸椎處死，取脾臟、胸腺和肝臟，稱重，計算臟器指數，公式如下：胸腺指數=胸腺質量（mg）/小鼠體重（g），脾臟指數=脾臟質量（mg）/小鼠體重（g），肝臟指數=肝臟質量（mg）/小鼠體重（g）（姜琛璐等，2013）。

1.2.3.2 正常小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的測定分組及給藥如1.2.3.1，給藥第21天后，禁食不禁水，稱體重，每只小鼠尾靜脈注射印度墨汁（10 mL·kg1），于注射后2 min（t1）和12 min（t2），分別從眼內眥靜脈叢取血20 μL，并將其溶于2.0 mL 0.1% Na2CO3溶液中，靜置10 min后，于680 nm處測吸光度值（A）。二次采血后將小鼠脫頸椎處死，稱肝臟、脾臟重量。細胞吞噬功能用廓清指數K值和校正廓清指數α值表示，公式如下：K=（logA1-logA2）/（t2-t1）；α=（肝+脾）質量×K3。

1.2.3.3 正常小鼠血清溶血素抗體形成的測定分組及給藥如1.2.3.1，從給藥第7天開始，每鼠通過腹腔注射方式給予5%雞紅細胞（CRBC）懸液0.2 mL進行免疫，連續7 d。免疫7 d后，小鼠繼續灌胃給藥7 d，末次給藥后，禁食不禁水，稱體重，摘眼球取血，3 000 r·min1分離血清，用生理鹽水稀釋100倍。取稀釋血清1 mL（其中空白對照以1 mL生理鹽水代替），與5% CRBC 0.5 mL、10%補體0.5 mL混合，在37 ℃水浴30 min，置0 ℃冰浴10 min終止反應，離心后取上清液，于540 nm處測定OD值，以OD值讀數作為判定血清溶血素的指標。

1.2.3.4 免疫力低下小鼠免疫器官重量的測定小鼠40只，隨機分為4組（每組10只）：空白組、模型組、千斤拔多糖低劑量組（500 mg·kg1）、千斤拔多糖高劑量組（1 000 mg·kg1）。連續灌胃給藥21 d（正常組和模型組給予等體積水），空白組小鼠隔天皮下注射生理鹽水（0.1 mL·10 g1），其他組小鼠隔天皮下注射環磷酰胺注射液（0.1 mL·10g1），注射5次，禁食不禁水，稱體重，脫頸椎處死，取胸腺、肝臟、脾臟，稱重，計算臟器指數，公式如下：胸腺指數=胸腺質量（mg）/小鼠體重（g）；脾臟指數=脾臟質量（mg）/小鼠體重（g）；肝臟指數=肝臟質量（mg）/小鼠體重（g）。

1.2.3.5 對免疫力低下小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的測定分組、造模及給藥同1.2.3.4，方法如1.2.3.2。

1.2.3.6 對免疫力低下小鼠血清溶血素抗體形成的測定分組、造模及給藥同1.2.3.4，方法如1.2.3.3。

1.3 數據統計分析

測定結果以x ± s表示，采用SPSS17.0軟件對結果進行t檢驗分析。P<0.01或P<0.05均為具有統計學意義。

2結果與分析

2.1 千斤拔多糖對正常小鼠免疫器官質量的影響

表1顯示，千斤拔多糖高、低劑量組的體重和肝臟指數與空白組比較，均無顯著性差異，對于胸腺指數及脾臟指數，千斤拔多糖高、低劑量組和空白組相比較有顯著性增加（P<0.01），具有統計學意義，說明千斤拔多糖可以增加胸腺和脾臟的重量。

2.2 千斤拔多糖對正常小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的影響

表2表明，千斤拔多糖高、低劑量組的廓清指數K值及校正廓清指數α值較空白組無明顯的變化，無統計學意義，但較空白組有增加的趨勢。

2.3 千斤拔多糖對雞紅細胞致正常小鼠血清溶血素抗體形成的影響

由表3可知，與空白組相比，千斤拔多糖高劑量組的吸光度顯著性高于空白組（P<0.01），說明千斤拔多糖增加了小鼠的血清溶血素抗體的形成，而千斤拔低劑量組對空白組小鼠的血清溶血素抗體的形成沒有顯著的提高。

2.4 千斤拔多糖對免疫力低下小鼠免疫器官質量的影響

由表4可知，模型組小鼠的體重、胸腺指數、脾臟指數及肝臟指數和空白組相比顯著性減?。≒<0.01）；千斤拔多糖高、低劑量組較模型組均顯著性提高小鼠的胸腺指數及脾臟指數（P<0.01或P<0.05），均具有統計學意義。對于肝臟指數，千斤拔多糖高劑量組較模型組顯著性增加小鼠的肝臟指數（P<0.05）。

2.5 千斤拔多糖對免疫力低下小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的影響

表5表明，模型組的廓清指數K值及校正廓清指數α值明顯低于空白組（P<0.01）。因此，模型組的小鼠單核巨噬細胞吞噬能力顯著低于空白組，造模成功；而千斤拔多糖高、低劑量組小鼠較模型組小鼠的廓清指數K值及校正廓清指數α值沒有顯著性變化，無統計學意義。

2.6 千斤拔多糖對雞紅細胞致免疫力低下小鼠血清溶血素抗體形成的影響

表6顯示，模型組的吸光度顯著性的低于空白組，說明小鼠血清溶血素抗體含量低于空白組，生成的抗體變少，免疫力下降，造模成功，而千斤拔多糖高劑量組則顯著高于模型組（P<0.01），千斤拔多糖低劑量組則無統計學意義，但有增加的趨勢。

3討論與結論

環磷酰胺在體內對異常細胞有殺傷作用的同時，其對體液免疫和細胞免疫均有抑制作用，環磷酰胺對B細胞的作用更顯著，對于受抗原刺激進入分裂時的B細胞和T細胞有相同的作用（韋鳳華，2013）。本研究采用隔天皮下注射環磷酰胺的方法，結果顯示小鼠的免疫器官指數，廓清指數及血清溶血素抗體的生成有明顯的降低。因此，此方法造模成功。機體的免疫系統由免疫細胞、 免疫活性物質和免疫器官組成，其中免疫器官分為中樞及外周免疫器官，其重量的多少往往意味著機體淋巴細胞的增殖與否，直接體現了非特異性免疫應答的強弱（姜琛璐等，2013；Xiong et al， 2013）。在本研究中，正常小鼠的胸腺指數及脾臟指數均有明顯的提高，而小鼠的體重沒有顯著的變化，可見，小鼠的胸腺和脾臟的重量有了明顯的增重，同樣，給藥組小鼠胸腺及脾臟的重量較模型組均有明顯的提高，因此，千斤拔多糖可以通過非特異性免疫提高正常小鼠的免疫功能。本研究還測定了肝臟指數，千斤拔多糖對于正常小鼠的肝臟無顯著性差別，但是對于免疫抑制小鼠，千斤拔多糖可以使其肝臟有所增重，因此千斤拔多糖是否有保肝的作用還有待于后面的實驗研究。單核巨噬細胞吞噬功能實驗屬于細胞免疫，碳廓清實驗結果以廓清率來判定，廓清率愈大，吞噬功能愈強，反之則弱（楊廷彬和尹學念，1994）。本研究結果雖無統計學意義，但其廓清指數較空白組或模型組有升高的趨勢，千斤拔多糖是否可以提高正?；蛎庖咭种菩∈蟮耐淌晒δ苓€需后面的驗證實驗。血清中溶血素實驗屬于體液免疫，經雞紅細胞免疫的實驗動物，可產生抵抗雞紅細胞抗體，如果把這種抗體在體外與補體、雞紅細胞一起溫育，可以使雞紅細胞溶解，釋放出血紅蛋白，從而使溶液成紅色，通過測定溶液顏色的深淺，可反映血紅細胞溶出量的多少，而紅細胞溶出量的多少與血清中抗體含量有關，從而可間接判斷血清中抗體形成的數量（駱和生，1999）。本研究結果表明，千斤拔多糖較空白組或模型組可以提高吸光度，增加血清中抗雞血紅細胞的抗體，說明千斤拔多糖可以通過體液免疫來增加正常和免疫抑制小鼠溶血素抗體。

綜上所述，千斤拔多糖可以通過提高正常及環磷酰胺所致的免疫力低下小鼠的免疫器官指數和血清溶血素抗體的生成，來增強正常及免疫抑制小鼠的免疫功能。這說明千斤拔多糖是其提高免疫力的有效成分，為后面千斤拔的開發利用提供了參考。

參考文獻：

CUI QQ， ZHOU ZY， LIU CQ， et al， 2015.Development in plantderived polysaccharides as immune adjuvant research [J]. Lishizhen Med Mat Med Res， 26（4）： 970-972. [崔倩倩， 周志勇， 劉朝奇， 等. 2015， 植物多糖作為免疫佐劑的研究進展 [J]. 時珍國醫國藥， 26（4）： 970-972.]

GE Y， DUAN YF， FANG GZ， et al， 2009. Study on biological activities of Physali salkekengi var. francheti polysaccharide [J]. J Sci Food Agric， 89（9）： 1593-1601.

JIANG SL， TANG C， SAI Y， et al， 2013. Immunoregulation effect of astragalus polysaccharides [J]. Food sci， 34（11）： 327-332. [姜琛璐， 湯承， 騫宇， 等， 2013. 黃芪多糖免疫調節作用研究進展 [J]. 食品科學， 34（11）： 327-332.]

LUO HS， 1999. The immune pharmacological and clinical immune chinese materia medica： traditional chinese medicine [M]. Beijing： Beijing medical university joint publishing house of beijing union medical college： 264. [駱和生， 1999. 免疫中藥學：中藥免疫藥理與臨床 [M]. 北京：北京醫科大學北京協和醫科大學聯合出版社： 264.]

SCHEPETKIN IA， QUINN MT， 2006. Botanical polysaccharides： Macroph age immunomodulation and therapetic potential [J]. Intern Imm Harmacol， 6（3）： 317-325.

TAO YW， TIAN GY， 2006. Studies on the physicochemical properties，structure and an titum or activity of polysaccharide YhPS1 from the root of Cordalisyanhusuo Wang [J]. Chin J Chem， 24（2）： 235-241.

WEI FH， 2013. Research progress of clinical application of cyclophosphamide [J]. Chin Pharm， 27（3）： 324-326. [韋鳳華， 2013. 環磷酰胺臨床應用研究進展 [J]. 中國藥事， 27（3）： 324-326.]

WEI YS， 1991. The classification and distribution of the genus Flemingia roxb. ex ait. in China [J]， Guihaia， 11（3）： 198-204. [韋裕宗， 1991. 中國千斤拔屬植物的初步研究 [J]. 廣西植物， 11（3）： 198-204.]

WU ZY， 1991. Xinhua medica outline [M]. Shanghai： Shanghai scientific and technical publishers： 229. [吳征鎰， 1991. 新華本草綱要 [M]. 上海： 上?？茖W技術出版社： 229.]

XIONG Q， JIAO Y， ZHAO X， et al， 2013. Purification，characterization and immunostimulatory activity of polysaccharide from Cipangopaludina chinensis [J]. Carbohyd Polym， 98（1）：217-223.

XU XZ， RAO H， CAI XF， et al， 2013. Study on extraction ofeucommia ulmoides oliv polysaccharide and effects of immune function in the mouse [J]. Lishizhen Med Mat Med Res， 24（3）： 541-542. [徐賢柱， 饒華， 蔡險峰， 等， 2013. 杜仲葉多糖提取及對小鼠免疫功能影響研究 [J]. 時珍國醫國藥， 24（3）： 541-542.]

XUE D， HUANG DD， HUANG GH， et al， 2014. The research progress of plant polysaccharides extraction purification [J]. J Chin Med Mat， 37 （1）： 157-161. [薛丹， 黃豆豆， 黃光輝， 等， 2014. 植物多糖提取分離純化的研究進展 [J]. 中藥材， 37 （1）： 157-161.]

YANG TB， YIN XN， 1994. Practical immunology [M]. Changchun： Changchun Press： 221. [楊廷彬，尹學念，1994. 實用免疫學 [M]. 長春： 長春出版社： 221.]

YE YX， LIN L， ZHAO JX， et al， 2015. Effects of Eucommia ulmoides oliv polysaccharide on modulating immune function in the mouse [J]. J Chin Med Mat， 38（7）： 1496-1498. [葉穎霞， 林嵐， 趙菊香， 等， 2015. 杜仲葉多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響 [J]. 中藥材， 38（7）： 1496-1498.]

ZHAO B， ZHANG YL DONG JM， 2010. Effects of polysaccharide from the fruit of Thladiantha dubia bunge on the immune functions of immunosuppressed mice [J]. Lishizhen Med Mat Med Res， 21（7）： 1627-1629. [趙波， 張玉玲， 佟繼銘. 2010， 赤雹果多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響 [J]. 時珍國醫國藥， 21（7）： 1627-1629.]

ZHUO S， CHEN J， QIN HG， et al， 2014. Investigation of the immunityenhancement capability of the Flemingia decoction in mice [J]. Lishizhen Med Mat Med Res， （25）11： 2641-2643. [卓燊， 陳君， 秦海洸， 等. 2014. 千斤拔對小鼠免疫功能的調節作用 [J]. 時珍國醫國藥， （25）11： 2641-2643.]