阿司匹林與華法林聯用在大鼠體內的藥效學研究

周峰++趙青

【摘 要】目的：研究阿司匹林與華法林聯用在大鼠體內的療效。方法：取成年SD雄性大鼠60只，體重180-200g之間，隨機分為三組：空白組、單用華法林組、阿司匹林與華法林聯用組。三組均灌胃7天，空白組灌服生理鹽水，單用華法林組灌服華法林（0.2mg/kg），聯用組灌服阿司匹林（10mg/kg）+華法林（0.2mg/kg）。七天后腹主動脈采血法測定三個藥效學指標：血小板聚集抑制率、凝血酶原時間和國際標準化比值、血小板胞內[Ca2+]i。結果：SD大鼠灌胃7天后腹主動脈采血測定，血小板聚集功能：空白組血小板聚集抑制率0.5%，單用華法林組血小板聚集抑制率23%，阿司匹林+華法林組血小板聚集抑制率68%，三組比較差異有統計學意義，P<0.05；凝血酶原時間和國際標準化比值：空白組凝血酶原時間16.7s，國際標準化比值1.12；單用華法林組凝血酶原時間20.1s，國際標準化比值1.58；阿司匹林+華法林組凝血酶原時間23.8s，國際標準化比值1.92，三組比較差異有統計學意義，P<0.05。血小板胞內[Ca2+]i測定：空白組血小板胞內[Ca2+]i （67.7±12.9）nmol/L；單用華法林組血小板胞內[Ca2+]i（54.5±11.4）nmol/L；阿司匹林+華法林組血小板胞內[Ca2+]i（43.7±10.9）nmol/L，三組比較差異有統計學意義，P<0.05。結論：阿司匹林與華法林聯用抗凝作用優于單用華法林組，可以用于凝血功能嚴重亢進，單用華法林無法有效控制的患者中，可以取得較好的抗凝效果，但是同時應注意兩藥聯用后的出血傾向，在實際應用中視具體情況而選擇藥物配伍。

【關鍵詞】阿司匹林 華法林 聯用

1 資料與方法

1.1 一般資料

取成年SD雄性大鼠60只，體重180-200g之間，隨機分為三組：空白組、單用華法林組、阿司匹林與華法林聯用組。

1.2 方法

三組均灌胃7天，空白組灌服生理鹽水，單用華法林組灌服華法林（0.2mg/kg）），聯用組灌服阿司匹林（10mg/kg）+華法林（0.2mg/kg）。七天后腹主動脈采血法測定三個藥效學指標：血小板聚集抑制率、凝血酶原時間和國際標準化比值、血小板胞內[Ca2+]i。

1.2.1 血小板聚集功能

（1）富血小板血漿（PRP）和貧血小板血漿（PPP）的制備。將灌胃后大鼠抽血于3.8%枸櫞酸鈉抗凝管內，800rpm離心6min得上清液即為富血小板血漿（platelet-rich plasma， PRP），剩余血液繼續離心2000rpm×10min得貧血小板血漿（platelet-poor plasma， PPP），用PPP調PRP血小板數為3×108/ml。

（2）Born比濁法測定血小板聚集功能于比濁管內加入500μl PPP調零（100%），同樣取500μlPRP，放入另一比濁管中，37℃預熱2min，加入誘導劑ADP，在電磁攪拌下觀察并記錄5min內血小板聚集情況，記錄血小板最大聚集率。按公式計算聚集抑制率：血小板聚集抑制率（%）=（對照組血小板聚集率—給藥組血小板聚集率）/正常對照血小板聚集率×100%。

1.2.2 凝血酶原時間的測定和國際標準化比值的計算

將冷凍保存的血漿解凍，取0.1 mL，37℃水浴預熱3分鐘，迅速加入預熱的PT試劑0.2 mL，混勻后立即計時，記錄凝血絲出現的時間，每個血樣重復測定兩次，兩次測定差值應在2S之內，取平均值，即為PT值。另取未用藥大鼠6只，測得其血漿PT值的均值為s，作為正常值（PTnor），與用藥大鼠的PT實驗值（PTexp）一同用于INR的計算：INR=（PTexp/PTnor）ISI，其中 ISI（International Sensitive Index）為國際敏感度指數，其值為1.85。

1.2.3 血小板胞內[Ca2+]i測定

（1）洗滌血小板懸液的制備。取1.1項方法制備的PRP，加1/4體積的ACD緩沖液（44mM枸櫞酸鈉，20mM檸檬酸，74mM葡萄糖，pH5.0），離心得片狀沉淀，用洗滌液（113mM NaCl，4mM KCl，24mM NaH2PO4，4mM Na2HPO4，0.2mM EGTA，0.1%葡萄糖，pH6.1）洗滌，離心1500rpm×10min，Hepes-Tyrode液（134 mM NaCl，12 mM NaHCO3，0.34 mM NaH2PO4，2.9 mM KCl，1 mM CaCl2，0.8 mM MgCl2，5 mM HEPES，5 mM 葡萄糖 pH 7.4）懸浮，調整血小板密度為2×108/ml。

（2）負載血小板懸液（Fura-2 platelet supension，FPS）的制備。將血小板懸液加入Fura-2/AM（熒光染料），使其終濃度為5μM，37℃恒溫避光溫育45min，使Fura-2/AM載入細胞內，將已負載的血小板懸液離心2000rpm×10min，去掉上清液，用洗滌液洗滌2遍后用Hepes-Tyrode液重新懸浮。調整血小板數至2×108/ml，測定熒光強度。

（3）血小板胞內[Ca2+]i測定。應用島津RF-5301PC熒光分光光度計作波長掃描，發射波長（Em）于500nm，掃描負載血小板懸液的激發波長，如激發波長（Ex）波峰由380nm移至340nm，表明Fura-2/AM已負載酯解進入細胞內，可作[Ca2+]i熒光測定。測定時Em為500nm（波寬10nm），Ex分別為340nm和380n（波寬5nm），波長變換時間間隔為2s。按以上參數執行雙波長測定，測定分組：分為靜息態和激活態（加入PAF，終濃度0.75ug/ml），靜息態和激活態均包括0.9%氯化鈉注射液組（NS組）和給藥組。應用熒光比值法連續描記靜息態和激活態的熒光強度比值（F340/F380）變化以及最大熒光強度比值（Rmax），最小熒光強度比值（Rmin）。

鈣離子濃度計算基本公式：

[Ca2+]i=Kd·[（R-Rmax）/（Rmin-R）]·（S1/S2）。〔公式中Kd是Fura-2與Ca2+反應的解離常數，37℃時為224nmol/L；Rmax是胞外游離鈣為1mmol/L時，加入Triton X-100（10%）破膜劑使Fura-2被Ca2+全部飽和時所測得的熒光比值；Rmin是Fura-2所結合Ca2+被EGTA全部螯合時的熒光比值。S1和S2分別為零Ca2+和Ca2+飽和時，在Ex 380nm測得的熒光強度。〕

1.3 統計學方法

使用統計學軟件spss18.0對所得數據進行統計學分析，計數資料采用x2檢驗，計量資料采用t檢驗，P<0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 血小板聚集功能

SD大鼠灌胃7天后腹主動脈采血測血小板聚集功能，其中空白組血小板聚集抑制率0.5%，單用華法林組血小板聚集抑制率23%，阿司匹林+華法林組血小板聚集抑制率58%，三組比較差異有統計學意義，P<0.05。

2.2 凝血酶原時間及國際標準化比值

SD大鼠灌胃7天后腹主動脈采血測凝血酶原時間和國際標準化比值，其中空白組凝血酶原時間16.7s，國際標準化比值1.04；單用華法林組凝血酶原時間20.1s，國際標準化比值1.42；阿司匹林+華法林組凝血酶原時間23.8s，國際標準化比值1.67，三組比較差異有統計學意義，P<0.05。

2.3 血小板胞內[Ca2+]i測定

SD大鼠灌胃7天后腹主動脈采血測凝血酶原時間和國際標準化比值，其中空白組血小板胞內[Ca2+]i （57.6±13.1）nmol/L；單用華法林組血小板胞內[Ca2+]i（43.4±12.5）nmol/L；阿司匹林+華法林組血小板胞內[Ca2+]i（32.6±11.3）nmol/L，三組比較差異有統計學意義，P<0.05。如表1所示。

3 討論

3.1 華法林

華法林影響外源性凝血因子VII的活性，口服華法林后通過監測其對外源性凝血系統的影響（凝血酶原時間，PT）來調整劑量。臨床使用標準化PT，即國際標準化比值（INR）來調整華法林的用藥劑量。INR=PTRISI，其中ISI為國際敏感指數，代表凝血活酶的促凝活（敏感性）；PTR為受試者PT與正常血漿PT的比值。

3.2 阿司匹林

ATC研究對不同劑量的阿司匹林在預防嚴重心腦血管事件方面的療效進行了薈萃分析，證實阿司匹林的長期使用最佳劑量為75～150mg/d[1]，增加阿司匹林的劑量并不能增強其抗血小板的功效而不良反應增加，劑量過小（<75mg/d）時，療效不確定。長期服用小劑量（75～150mg/d）阿司匹林，能夠獲得相對最佳的耐受性和療效。在急性期，為了快速抑制血小板聚集，應該給予150～300rng負荷劑量，腸溶片劑應該嚼服。

3.3 阿司匹林與華法林聯用

從上文中得出的結果所示：SD大鼠灌胃7天后腹主動脈采血測定，血小板聚集功能：空白組血小板聚集抑制率0.5%，單用華法林組血小板聚集抑制率23%，阿司匹林+華法林組血小板聚集抑制率58%，三組比較差異有統計學意義，P<0.05；凝血酶原時間和國際標準化比值：空白組凝血酶原時間16.7s，國際標準化比值1.04；單用華法林組凝血酶原時間20.1s，國際標準化比值1.42；阿司匹林+華法林組凝血酶原時間23.8s，國際標準化比值1.67，三組比較差異有統計學意義，P<0.05。血小板胞內[Ca2+]i測定：空白組血小板胞內[Ca2+]i （67.7±12.9）nmol/L；單用華法林組血小板胞內[Ca2+]i（54.5±11.4）nmol/L；阿司匹林+華法林組血小板胞內[Ca2+]i（43.7±10.9）nmol/L，三組比較差異有統計學意義，P<0.05。可見，阿司匹林與華法林聯用，在血小板抑制率，凝血酶原時間和國際標準化比值及血小板胞內Ca2+濃度方面，均優于單用華法林組，兩要聯用使抗血小板作用與抗外源性凝血途徑作用結合，在臨床上可以發揮更強的抗凝作用，可以應用于單用華法林無法控制的頑固性高凝狀態患者。但是血小板系統及凝血因子的功能同時被抑制，增加了用藥后的出血風險，從結果中可以看出，兩藥聯用后，凝血酶原時間顯著增加，血小板抑制率大幅上升，當應用于患者身上時，有可能導致患者由高凝狀態轉變為凝血功能不足，引發出血，甚至危及生命[2]。從本文的結果中，我們可以得知，對于不同藥理的藥物配伍使用，應當結合具體情況，在使用過程中密切監測患者血液系統指標，以期達到在藥物的作用下，患者凝血指標值基本保持在正常范圍內。

阿司匹林與華法林的聯用已有多年的研究歷史，但是由于在臨床使用時無法把握好使用的比例和聯用時機、時間，導致兩藥聯用受到限制。只要正確的了解阿司匹林與華法林的藥理特性，密切監測聯用時的血液學凝血系統指標，兩藥的聯用必將成為各類凝血系統亢進疾病的有效治療方式。

參考文獻：

[1]莫衛民，景華，陳冰，等.心臟瓣膜置換病人口服華法林后的對映體藥動學研究[J].中國藥學雜志，2007，32（3）：52.

[2]陳修，陳維洲，曾貴云.心血管藥理學[M].人民衛生出版社，2009：569.