低鹽脅迫對紅鰭東方鲀幼魚肝臟的酶活性、組織結(jié)構(gòu)及免疫基因表達(dá)的影響

孫夢蕾　姜志強(qiáng)　蔣潔蘭　王莉蘋

摘 要：為探討低鹽脅迫下肝臟在紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）機(jī)體免疫中的作用，在肝臟酶活性、組織結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)水平3個(gè)方面進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，低鹽（鹽度4‰）脅迫下紅鰭東方鲀肝臟中總超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）的酶活性顯著高于對照組（P<005）；肝臟組織結(jié)構(gòu)中肝細(xì)胞發(fā)生腫大，形狀變形；肝臟IL15和TLR3基因的表達(dá)量顯著升高（P<0.05），而IRF2基因的表達(dá)量卻未有顯著性差異（P>0.05）。

關(guān)鍵詞：紅鰭東方鲀；肝臟；酶活性；組織結(jié)構(gòu)；基因表達(dá)

紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）屬鲀形目（Tetraodontiformers）、鲀亞目（Tetraodontoidei）、鲀科（Tetraodontidae）、東方鲀屬（Takifugu），屬于廣鹽性底棲魚類，適鹽范圍為5‰～45‰，最適鹽度為15‰～35‰[1-2]，生活于近海底層區(qū)域，因其肉質(zhì)鮮嫩、味道獨(dú)特、營養(yǎng)價(jià)值高，因而成為人們廣泛喜愛的美食之一。因紅鰭東方鲀對鹽度的適應(yīng)性較強(qiáng)，所以紅鰭東方鲀成為眾多學(xué)者研究鹽度變化對魚類影響的重要材料。

鹽度是魚類生存、生長的重要影響因子之一，尤其對廣鹽性魚類來說，所生存的水環(huán)境的鹽度變化會(huì)引起魚類體內(nèi)酶活性、組織結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)量的適應(yīng)性改變[3-4]，研究低鹽條件下魚類機(jī)體的生理響應(yīng)，可幫助了解魚類的抗低鹽機(jī)制，指導(dǎo)魚類的健康養(yǎng)殖。本論文通過對紅鰭東方鲀在鹽度變化過程中肝臟酶活性、組織結(jié)構(gòu)及相關(guān)免疫基因的研究，探討肝臟在紅鰭東方鲀機(jī)體免疫中的作用，可為紅鰭東方鲀對鹽度變化的適應(yīng)性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

所用紅鰭東方鲀幼魚均購自大連天正實(shí)業(yè)有限公司，于大連海洋大學(xué)北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d后，從中選取平均體長為（7.18±034）cm，平均體重為（11.34±2.13）g的健康個(gè)體于容積為200 L的方形水槽中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，24 h連續(xù)充氣。實(shí)驗(yàn)用水為凈化處理的天然海水（鹽度32‰）和與曝氣后自來水配制成的低鹽度海水。

鹽度設(shè)為32‰（對照組）和4‰（低鹽度組），每個(gè)鹽度設(shè)三個(gè)平行。每個(gè)鹽度每個(gè)水槽中隨機(jī)放入10尾紅鰭東方鲀幼魚，養(yǎng)殖水溫（25.03±042） ℃，每天投喂兩次，表觀飽食。投喂 1 h 后吸底換水。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為30 d。

1.2 樣品采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)鹽度每槽中取2尾幼魚，即每個(gè)實(shí)驗(yàn)組取6尾魚，用MS-222麻醉后解剖取其肝臟全部，觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)。另外，每組再取6尾魚，麻醉解剖取少許肝臟各兩份，分別用于酶活性與基因表達(dá)量的測定。

1.3 肝臟酶活性的測定

所取肝臟用0.9%的生理鹽水沖洗干凈，液氮速凍后保存于-80 ℃，用于酶活性測定和免疫基因表達(dá)量測定。酶活性檢測前取出肝臟，加入肝臟質(zhì)量9倍的生理鹽水，剪碎并研磨后，4 ℃、2 500 r·min-1離心10 min，取上清用以測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）的活性，測定時(shí)均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，測定步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4 肝臟組織結(jié)構(gòu)的觀察

取得的兩組紅鰭東方鲀幼魚的全部肝臟，均用Bouin氏液固定24 h，之后用75%的酒精對肝臟組織進(jìn)行洗滌至溶液呈無色，最后放置在70%的酒精中保存以備后期切片制作。制作切片時(shí)用常規(guī)石蠟包埋，橫向連續(xù)切片，厚度均為6 μm，HE染色，中性樹膠封片[5]。

1.5 熒光定量檢測肝臟相關(guān)基因mRNA表達(dá)的差異

根據(jù)天根生物公司的動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒說明，提取兩個(gè)鹽度處理下幼魚的肝臟組織總RNA，OD260/OD280比值在1.9～2.1內(nèi)的RNA可根據(jù)PrimerScriptTM RT Reagent kit試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所得產(chǎn)物于-20 ℃保存。

根據(jù)NCBI中已報(bào)道的紅鰭東方鲀IL15（Interleukin 15）（NM_001033048）、IRF2（Interferon regulatory factor 2）（XM_011620053）、TLR3（Toll-like receptor 3）（AC156436）和β-actin（XM_003964421）的基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)熒光定量引物，如表1所示。以兩個(gè)鹽度下紅鰭東方鲀幼魚肝臟的cDNA為未知樣品模板，以β-actin為內(nèi)參基因，檢測IL15、IRF2、TLR3基因的表達(dá)量，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)平行。最后用2-△△CT方法來計(jì)算3個(gè)基因的相對表達(dá)量[6]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示，運(yùn)用SPSS 16.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著的進(jìn)行Tukey法多重比較分析，當(dāng)P<0.05時(shí)表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 低鹽脅迫對紅鰭東方鲀幼魚肝臟免疫酶活性的影響

低鹽（鹽度4‰）脅迫下紅鰭東方鲀肝臟免疫酶活性的變化情況見表2。從表2可看出鹽度4‰處理后，紅鰭東方鲀肝臟中總超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）的酶活性顯著高于對照組（鹽度32‰）的肝臟酶活性。

2.2 低鹽脅迫對紅鰭東方鲀幼魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

低鹽（鹽度4‰）脅迫30 d后，紅鰭東方鲀幼魚肝臟中免疫基因IL15、IRF2和TLR3表達(dá)量的影響見圖2。從圖2中可看出，與對照組相比，低鹽脅迫下紅鰭東方鲀幼魚肝臟IL15和TLR3的表達(dá)量顯著升高（P<0.05），而IRF2的表達(dá)量卻未有顯著性差異（P>0.05）。

3 討論

鹽度是影響魚類生存的重要環(huán)境因子之一，鹽度的變化會(huì)導(dǎo)致魚類體內(nèi)的酶活性、組織結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)水平發(fā)生變化。肝臟是魚類體內(nèi)重要的以代謝為主的器官，在糖類、脂肪和蛋白質(zhì)的合成與分解代謝中起著至關(guān)重要的作用，因此肝臟功能的強(qiáng)弱可作為魚類抵抗外界環(huán)境脅迫能力大小的重要指標(biāo)。

魚類肝臟中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）和 堿性磷酸酶（AKP）是評價(jià)魚類非特異免疫性的重要指標(biāo)。魚類在一旦受到鹽度脅迫，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（如過氧化氫、超氧陰離子和羥基自由基），這些活性氧易使魚類細(xì)胞被氧化損傷，進(jìn)而破壞魚類機(jī)體的生理機(jī)能[7-8]。SOD和CAT二者具有消除活性氧以降低細(xì)胞損傷的作用，因此，SOD和CAT的活性可反映魚類機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的受損程度[9]。本實(shí)驗(yàn)中，鹽度4‰條件下處理30 d后紅鰭東方鲀幼魚肝臟中SOD、CAT活性顯著增強(qiáng)，表明低鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致活性氧自由基在紅鰭東方鲀體內(nèi)積累，進(jìn)而損傷細(xì)胞。ACP和AKP作為巨噬細(xì)胞溶酶體酶的重要組成部分可在魚類機(jī)體內(nèi)的磷酸基團(tuán)代謝起重要作用，這兩種酶亦可催化磷酸酯類的水解產(chǎn)生合成ATP所需的無機(jī)磷酸，ACP和AKP以代謝調(diào)控酶的形式在免疫反應(yīng)中產(chǎn)生重要的影響[10]。鹽度是影響其變化的重要環(huán)境因子，本研究中鹽度4‰處理30 d后，ACP、AKP活性顯著升高（P<0.05），原因可能是低鹽刺激后幼魚需要消耗ATP來調(diào)節(jié)機(jī)體滲透壓以適應(yīng)鹽度的變化，而ACP和AKP催化磷酸酯類水解產(chǎn)生的無機(jī)磷酸是合成ATP的材料，因此，低鹽脅迫會(huì)最終導(dǎo)致ACP和AKP活性的增強(qiáng)。

說明：1—對照組紅鰭東方鲀幼魚肝組織結(jié)構(gòu)；2—低鹽組紅鰭東方鲀幼魚肝組織結(jié)構(gòu)；箭頭所指為肝細(xì)胞；CV：中央靜脈。

與對照組相比，經(jīng)鹽度4‰脅迫30 d后紅鰭東方鲀幼魚肝臟結(jié)構(gòu)中變化最大的是肝細(xì)胞，肝細(xì)胞發(fā)生腫大膨脹，形狀變形。

2.3 低鹽脅迫對紅鰭東方鲀幼魚肝臟免疫相關(guān)基因的影響

本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)鹽度4‰處理30 d后，肝臟組織結(jié)構(gòu)中肝細(xì)胞體積增大，可能是由于紅鰭東方鲀幼魚為了適應(yīng)低鹽度環(huán)境，將體內(nèi)的更多的能量用于機(jī)體滲透壓的調(diào)節(jié)，在此過程中，糖酵解反應(yīng)的進(jìn)行使得肝臟中肝糖原得以大量積累，由此可供機(jī)體內(nèi)部所需的大量能量，而肝糖原的過多積累則會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞體積的增大膨脹[11]。

白細(xì)胞介素（IL）主要在信號傳遞、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化等方面起作用[12]。白細(xì)胞介素15（IL15）是重要的細(xì)胞因子之一，具有多種功能，如刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)免疫球蛋白分泌、促進(jìn)轉(zhuǎn)錄蛋白合成等。干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）是一種轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)I型干擾素、干擾素刺激基因的表達(dá)[13]。Toll樣受體（TLRs）是一種跨膜受體，位于細(xì)胞表面，主要作用于信號傳導(dǎo)，在識別病原、激活先天免疫和誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫方面具有重要作用[14]。目前，在硬骨魚類中發(fā)現(xiàn)了 17 種TLRs[15]，TLR3是其中之一。本實(shí)驗(yàn)中，低鹽處理30 d后紅鰭東方鲀幼魚肝臟IL15和TLR3基因的表達(dá)量顯著升高（P<0.05），說明紅鰭東方鲀幼魚在受到鹽度脅迫時(shí)，免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的增加可增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，從而有效的抵抗外界環(huán)境變化帶來的影響。

綜上所述，低鹽脅迫對紅鰭東方鲀幼魚肝臟酶活性（SOD、CAT、ACP、AKP）、組織結(jié)構(gòu)、免疫相關(guān)基因（IL15、IRF2、TLR3）的表達(dá)水平具有重要影響，而這些指標(biāo)的變化會(huì)加強(qiáng)幼魚的免疫能力。此結(jié)果可為紅鰭東方鲀的低鹽化養(yǎng)殖提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)材料。

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（收稿日期：2016-12-01）