高效液相色譜法測定藍莓葉中綠原酸的含量

張盈嬌，陳 建，夏 陳，鄧俊琳，李艷琳，李 娟

(四川省農業科學院農產品加工研究所，成都 610066)

高效液相色譜法測定藍莓葉中綠原酸的含量

張盈嬌，陳 建，夏 陳，鄧俊琳，李艷琳，李 娟

(四川省農業科學院農產品加工研究所，成都 610066)

采用高效液相色譜法測定藍莓葉中綠原酸的含量。所用色譜柱為Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，2.5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸(體積比為13：87)，檢測波長327 nm。當綠原酸質量濃度為6～96μg/mL時，以綠原酸對照品溶液的峰面積比為縱坐標(Y)、綠原酸的質量濃度為橫坐標(X)進行線性回歸，二者呈良好的線性關系，線性方程為：Y=74.15X-432.3，R2=0.999，平均回收率為99.98%，RSD=0.506%(n=6)。按照以上色譜方法檢測了3種藍莓葉中綠原酸的含量，并與藍莓果實中綠原酸的含量比較，結果顯示，3種藍莓葉中的綠原酸含量顯著高于對應品種果實中的綠原酸含量(P<0.05)。

HPLC；藍莓葉；綠原酸

藍莓果實中的花青素在保護視力、改善靜脈等血液循環的系統結構、延緩皮膚衰老方面有顯著作用[1-2]。藍莓葉中含有豐富的綠原酸、花色苷、多種微量元素等活性成分，但豐富的藍莓葉并未得到良好得利用[3-4]。綠原酸具有抗菌、抗病毒、清除自由基和興奮中樞神經系統等作用[5-6]，目前，鮮見藍莓葉中綠原酸的含量分析報道。本文通過對不同品種藍莓葉中綠原酸的含量測定，與藍莓果實中綠原酸的含量比較，為藍莓葉中綠原酸資源的開發和利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司；TG-16S臺式高速離心機，四川蜀科儀器有限公司；KH2200DE型數控超聲清洗機，昆山禾創超聲儀器有限公司；FA2104電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，乙酸、磷酸為分析純，超純水(實驗室自制)；藍莓品種：奧尼爾、圓藍、密斯特，均采自四川省農業科學院經濟作物研究所成都市青白江區科研基地；綠原酸標準品(批號：GZDD-0038，質量純度：≥98.731%)，貴州迪大生物科技責任有限公司。

1.2 方法

(1)檢測波長的選擇：精密稱取綠原酸標準品 5 mg，用50%的甲醇溶液溶解并定容至50 mL的棕色容量瓶中，混勻，在波長為200～700nm范圍內掃描。(2)色譜析條件：色譜柱：Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，2.5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸(體積比為13∶87)、流速1mL/min、柱溫25℃、檢測波長327 nm、進樣量20μL[7-9]。(3)線性關系考察：精密稱取綠原酸標準品，用50%甲醇溶解配制成96μg/mL的標準品溶液，再將其稀釋為48、36、24、12、6μg/mL的溶液，按照1.2.2方法進行高效液相色譜法分析。(4)供試品的制備：藍莓葉于50℃烘干，粉碎，過100目篩，置索氏提取器中40～50℃石油醚脫脂處理，過濾，揮干，精密稱取殘渣約15g，加入25mL甲醇-10%乙酸(85∶15)提取液，于0～4℃勻漿，移入50mL棕色容量瓶，超聲提取30min，定容，離心(12 000r/min)5min，上清液用0.22μm濾膜過濾，按照1.2(2)方法進行檢測。

1.3 方法學考察

(1)精密度試驗：取同一標準品溶液，按照1.2中(2)色譜條件連續檢測6次，以峰面積計算RSD。(2)重復性試驗：取同一批樣品，按照1.2(4)的方法制備5份樣品溶液，按照1.2(2)色譜方法進行分析。(3)穩定性試驗：取標準品溶液，按照1.2(2)色譜條件，在8h內測定5次。(4)加標回收試驗：精確稱取6份已知含量的同一樣品7.5g分別置于50mL容量瓶中，分別精確加入標準品溶液25mL(含綠原酸標準品866.667μg)，用甲醇-10%乙酸(85：15)定容，混勻，按照1.2(2)項下方法進行測定。(5)樣品的測定：將按1.2(4)所述方法制備的供試品溶液注入高效液相色譜儀，測定了3個藍莓品種葉片中綠原酸的含量(每個品種檢測5批平行樣品)，并與對應的藍莓果實中的綠原酸含量進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 檢測波長

以波長為橫坐標、吸光度為縱坐標作圖，綠原酸標準品溶液在327nm處有較強的紫外吸收，故選擇327nm作為檢測波長。

2.2 線性關系

以綠原酸標準品溶液濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸。回歸方程：Y=74.15X-432.3，R2=0.999，結果表明，綠原酸標準品溶液在6～96μg/mL范圍內線性關系良好(圖1)。

圖1 綠原酸標準曲線

2.3 供試品檢測

圖2～4結果顯示，綠原酸與其他組分峰分離良好。

圖2 綠原酸標準品色譜

2.4 方法學考察

(1)精密度考察：同一標準品6次檢測結果的RSD為1.54%，表明該方法精密度良好。(2)重復性考察：5份樣品以峰面積計算RSD為6.679%，表明該方法穩定，重復性良好。(3)穩定性分析：標準品溶液5次檢測結果以峰面積計算RSD，RSD為2.15%，表明樣品在8h內穩定。(4)加標回收率結果：6份樣品加標回收后計算回收率。結果平均回收率為99.98%，RSD=0.506%(n=6)，回收率良好。(5)樣品檢測結果：樣品檢測結果表明，3種藍莓葉中的綠原酸含量與對應品種果實中綠原酸的含量有顯著差異(P<0.05)(附表)。

圖3 藍莓葉樣品色譜圖

圖4 藍莓果實中綠原酸的色譜圖

附表 藍莓葉和果實中綠原酸的含量

樣品名稱綠原酸含量(mg/g)奧尼爾葉9 969±0 21?圓藍葉6 287±0 32?密斯特葉12 124±0 51?奧尼爾果實0 099±0 004圓藍果實0 192±0 025密斯特果實0 187±0 031

注：*與對應品種的果實有顯著差異(P<0.05)

3 結論

(1)本研究建立的高效液相色譜法可使雜質峰和藍莓葉樣品峰實現良好得分離。本方法簡便、穩定、可靠、精確，為藍莓葉中綠原酸含量的分析提供了一個新方法。(2)綠原酸分子式是C16H18O9，其分子具有鄰苯二酚的羧基結構，在植物體中常以鹽的形式存在，提取時以含乙酸的甲醉溶液為提取液，使綠原酸呈分子狀態而被甲醇完全提取出[10]。(3)樣品含量分析結果表明，3種藍莓葉中的綠原酸含量遠高于果實中的綠原酸含量。◇

[1]楊貴云，錢炳俊，等.藍莓品種及提取方法對藍莓葉生物活性的影響[J].上海交通大學學報(農業科學版)，2014，32(1)：49-52.

[2]張永蘭，王建娟，等.六種藍莓葉綠素、干物質及脯氨酸含量的比較研究[J].安徽農業科學，2014，42(10)：2848-2849.

[3]馮進，李敏，等.大孔樹脂純化藍莓葉多酚及其組成分析[J].食品科學，2013，34(10)：86-91.

[4]李穎暢，馬春穎，等.藍莓葉水溶性和醇溶性提取物的抗氧化作用[J].食品與發酵科技，2014，50(2)：31-35.

[5]龍妍，姜自軍，等.HPLC法測定藍莓中綠原酸的含量[J].中國食物與營養，2011，17(3)：60-62.

[6]戴開金，羅奇志，等.HPLC法測定桑葉中蘆丁、綠原酸和槲皮素[J].南方醫科大學學報，2009，29(3)：579-580.

[7]于加平，等.HPLC法測定金銀木花和葉中綠原酸的含量[J].吉林農業科技學院學報，2009，18(1)：1-2.

[8]何希瑞，等.不同采收時間及干燥方法對杜仲葉中綠原酸含量的影響[J].西北藥學雜志，2013，28(2)：130-132.

[9]趙永成.高效液相色譜法測定杜仲葉中的綠原酸[J].色譜，2000，18(3)：263-264.

[10]李坤，武瑞，等.杜仲葉中綠原酸含量測定方法的建立[J].中國獸醫雜志，2015，5l(3)：61-63.

(責任編輯 李婷婷)

Quantitative Determination on Chlorlgenic Acid in Blueberry Leaf by HPLC

ZHANG Ying-jiao，CHEN Jian，XIA Chen，DENG Jun-lin，LI Yan-lin，LI Juan

(Institute of Agro-products Processing Science and Technology，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China)

An HPLC method for the quantitative determination of chlorlgenic acid in blueberry leaf was investigated.The operating conditions were Eclipse XDB C18column (250 mm×4.6 mm，2.5 μm)，mobile phase of acetonitrile-0.1%H3PO4(13：87，V/V)，at 1 mL/min and UV detection at 327 nm.There was a good linear relationship between the response and the concentration of sampleat the range of 6～96mg/L for chlorlgenic acid.The corresponding regression equation was Y=74.15X-432.3，R2=0.999.The average recovery was 99.98% and RSD was 0.506% (n=6).The results showed that this method was simple，specific and accurate.According to the above chromatographic method to detect content of chlorlgenic acid in three kinds of blueberry，and compared with the content of chlorlgenic acid in blueberry fruit，the results showed that three kinds of blueberry leaves the chlorlgenic acid content was higher than the content of chlorlgenic acid in fruit.

HPLC；blueberry leaf；chlorlgenic acid

四川省農業科學院人才經費。

張盈嬌(1981— )，女，碩士，研究員，研究方向：功能食品及藥物化學。

陳建(1969— )，男，博士，研究員，研究方向：功能食(藥)品研究開發。