灰樹花液態發酵培養基優化研究

吳 強 胡寶坤

（1威高泰爾茂（威海）醫療制品有限公司，山東威海264210；2青島綠十字高邦職業安全咨詢事務所有限公司，山東青島266011）

真菌多糖以其獨特的生物活性而引起人們越來越多的關注。灰樹花（Grifola frondosa）是亞熱帶至溫帶森林中的一種大型藥、食兼用珍稀真菌。灰樹又名貝葉多孔菌、栗子蘑、蓮花菌，日本俗名舞茸。鮮灰樹花肉質脆嫩，味如雞絲，營養豐富，且含有生物活性物質，具有獨特的營養和藥用價值，成為當前的研究熱點。這種傳奇的菇類直到20世紀80年代中期才人工栽培成功，此后以日本為主的科學家在化學、生化學、藥理學等方面對灰樹花進行了廣泛的研究，證明了灰樹花是非常有價值的藥食兩用菇類，特別是從灰樹花中提取的最有效活性成分灰樹花D-fraction具有極強的抗癌功效[1-6]。

目前有關灰樹花的產品大多都是從子實體中提取得到的，雖然灰樹花人工栽培技術已經很成熟，但人工栽培周期長，而液態發酵培養菌絲體要比固態培養子實體簡單迅速，同時深層發酵得到的灰樹花菌絲體不但具有和子實體相當的營養及藥用效果，還可得到胞外多糖等子實體所不具備的營養保健成分[7-8]。因此采用深層發酵方法生產灰樹花菌絲體可以部分替代灰樹花子實體，降低生產成本。灰樹花屬多孔菌屬，在液態深層培養條件下代謝能力強，是多糖富集的良好載體。筆者對灰樹花發酵條件及對影響灰樹花深層發酵得胞外多糖的因素進行研究。現將有關結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株灰樹花菌株GWH，購自華中農大食用菌科研教學基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 碳源對灰樹花深層發酵的影響 選擇葡萄糖、蔗糖、淀粉、馬鈴薯+葡萄糖分別作為發酵培養基的碳源進行考察：葡萄糖80 g/L、蔗糖80 g/L、淀粉80 g/L、馬鈴薯180 g/L（取浸提液）+葡萄糖20 g/L。

培養基：碳源、豆餅粉10 g/L（降解浸提液）、麩皮20 g/L（浸提液）、KH2PO41 g/L、CaCl21 g/L、MgSO42 g/L、VB10.2 g/L，pH 6.5。每種配方重復3次，結果取無顯著差異的數值的平均值。

1.2.2 氮源對灰樹花深層發酵的影響 選擇豆餅粉、蛋白胨及谷氨酸發酵廢液（用味精代替）分別作為發酵培養基的氮源進行考察：豆餅粉10 g/L（降解浸提液）、蛋白胨10 g/L、味精10 g/L。

培養基：氮源、馬鈴薯180 g/L（取浸提液）+葡萄糖20、麩皮20 g/L（浸提液）、KH2PO41 g/L、CaCl21 g/L、MgSO42 g/L、VB10.2 g/L，pH6.5。每種配方重復3次，結果取無顯著差異的數值的平均值。

1.2.3 發酵培養基的優化 采用L9（34）正交表，固定其它的因素，以篩選出的碳源、氮源以及pH作為因子，第四列為空列（表1），進行正交試驗（表2），以確定其最佳培養基配方。

表1 灰樹花深層發酵培養基優化正交試驗因素水平

其它成分：麩皮20 g/L（浸提液）、KH2PO41 g/L、CaCl21 g/L、MgSO42 g/L、VB10.2 g/L。

1.2.4 發酵培養基的驗證 按1.2.3試驗方法確定的最佳培養基配方進行三批發酵試驗，以對發酵條件進行驗證。

1.3 測定方法

1.3.1 灰樹花菌絲體生物量測定 取1.3.2.1離心后沉淀物無菌水反復沖洗后，60℃烘干至恒重，電子天平稱重。

1.3.2 多糖的測定方法 采用苯酚-硫酸法[9]，以葡萄糖為標準品。

1.3.2.1 胞外多糖的測定 取5 mL發酵液，4000 r/min離心15 min，上清液加3倍酒精，4℃冰箱中靜置過夜完全沉淀后加去離子水適度稀釋，測定胞外多糖含量。

1.3.2.2 胞內多糖的測定 取1.3.1的干菌絲加入30 mL去離子水在80℃溫度下蒸煮3 h后過濾，反復2次，合并2次上清液，濃縮至30 mL并冷卻至室溫，加入3倍酒精，4℃冰箱中靜置過夜完全沉淀后加去離子水適度稀釋，測定胞內多糖含量。

1.3.2.3 標準曲線的繪制 按表3量取葡萄糖標準液并稀釋成相應濃度，在490 nm波長下測定吸光度值，繪制標準曲線。

表2 L 9（34）正交表

表3 多糖測定標準曲線繪制表

所得標準曲線如圖1。

圖1 灰樹花多糖測定標準曲線

1.3.2.4 樣品含量測定 吸取樣品液1.0 mL（相當于40μg左右的多糖），按上述顯色操作，測光密度，以標準曲線計算多糖含量。

1.4 培養方法種子培養液按10%接種量接入液態培養基，26℃，150 r/min，培養10 d。

2 結果與分析

2.1 碳源對灰樹花深層發酵產多糖及菌絲生長的影響不同碳源對灰樹花深層發酵產多糖及菌絲生長影響的結果見表4。結果表明：葡萄糖和蔗糖作為碳源的培養基胞外多糖產量較低，最適于灰樹花發酵產糖及菌絲體生長的碳源為馬鈴薯+葡萄糖；葡萄糖和馬鈴薯+葡萄糖作為碳源的培養基利于菌絲體生長，胞內多糖含量高。但在發酵過程中，淀粉和馬鈴薯+葡萄糖中所含的多糖一部分被灰樹花菌絲體利用，另一部分被水解為其它糖類，可能會使測定結果偏高。綜合各方面的因素，采用馬鈴薯+葡萄糖作為碳源最為合適。

表4 不同碳源對灰樹花深層發酵產胞內外多糖及菌絲生長的影響

表5 不同氮源對灰樹花深層發酵產胞內外多糖及菌絲生長的影響

2.2 氮源對灰樹花深層發酵產多糖及菌絲生長的影響不同氮源對灰樹花深層發酵產多糖及菌絲生長影響的結果見表5。結果表明：豆餅粉、蛋白胨、味精對灰樹花深層發酵產胞外多糖及菌絲生長的影響不大，其中豆餅粉稍有利于菌絲體的生長，而味精作氮源時胞外多糖稍高，考慮成本及原料來源，采用豆餅粉作為灰樹花深層發酵優化試驗氮源。

2.3 發酵培養基的優化

以胞外多糖為指標的正交試驗結果如表6所示。

表6 灰樹花液態發酵培養基優化正交試驗結果

表6 方差分析

由方差分析初步可知，影響灰樹花深層發酵得胞外多糖的因素主次順序為：A＞C＞B＞D，即碳源影響顯著，最佳組合為A3B2C2D，因B因素間差異不顯著，考慮到節約原料，因此選擇B因素最佳水平為1，所以最佳組合為A3B1C2，即最佳發酵培養基：馬鈴薯225 g/L、葡萄糖25 g/L、豆餅粉6 g/L、麩皮20 g/L（浸提液）、KH2PO41 g/L、CaCl21 g/L、MgSO42 g/L、VB10.2 g/L，pH6.5。

2.4 發酵培養基的驗證三批驗證試驗結果如表7。由表7結果可知，該培養基配方適合用于灰樹花的深層發酵培養產多糖。

表7 三批驗證試驗結果

3 結 論

試驗篩選出最適于灰樹花發酵產多糖及菌絲體生長的碳源為馬鈴薯+葡萄糖，氮源為豆餅粉；得到最佳培養基配方為馬鈴薯225 g/L、葡萄糖25 g/L、豆餅粉6 g/L、麩皮20 g/L（浸提液）、KH2PO41 g/L、CaCl21 g/L、MgSO42 g/L、VB10.2 g/L、pH6.5。