鹽穗木鹽相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子HcSCL13基因啟動(dòng)子的克隆及活性初步分析

樊壽德 王艷

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

鹽穗木鹽相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子HcSCL13基因啟動(dòng)子的克隆及活性初步分析

樊壽德 王艷

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

為探明鹽穗木鹽相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因HcSCL13的表達(dá)調(diào)控規(guī)律，利用基因組步移法成功克隆獲得該基因2 200 bp 的啟動(dòng)子序列。PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明，該啟動(dòng)子不僅含有啟動(dòng)子區(qū)的核心元件 CAAT-box和 TATA-box，還包含多個(gè)與逆境應(yīng)答有關(guān)的順式調(diào)控元件。將克隆獲得的 HcSCL13轉(zhuǎn)錄因子基因啟動(dòng)子序列定向替換pBI121載體上的35S啟動(dòng)子，構(gòu)建融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染模式植物擬南芥，對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥整株被染色，提示該啟動(dòng)子具有表達(dá)活性且可能為組成型啟動(dòng)子。

鹽穗木轉(zhuǎn)錄因子HcSCL13基因；染色體步移；啟動(dòng)子克隆；元件及啟動(dòng)活性分析

基因的表達(dá)可受轉(zhuǎn)錄、翻譯等不同水平上的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控在植物基因調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，涉及多種順式作用元件和反式作用因子。啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄水平上重要的調(diào)控元件，通常是指位于基因上游，緊鄰轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的一段提供RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，通過與特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，控制基因轉(zhuǎn)錄的起始、效率及時(shí)空特異性。啟動(dòng)子的特定基序也可響應(yīng)激素（生長(zhǎng)素、脫落酸、赤霉素、茉莉酸、油菜素內(nèi)酯、水楊酸）［1，2］和環(huán)境脅迫（冷脅迫、傷害脅迫、干旱脅迫及高鹽脅迫）等［3，4］，從而調(diào)節(jié)下游基因應(yīng)對(duì)環(huán)境變化。因此，對(duì)啟動(dòng)子及其基序進(jìn)行分析有助于進(jìn)一步了解下游基因的表達(dá)模式及生理調(diào)節(jié)。在轉(zhuǎn)基因植物研究中，組成型啟動(dòng)子，如35S［5，6］、Actin［7］和 Ubipuitin［8，9］的啟動(dòng)子，已被廣泛應(yīng)用。

GRAS家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，由最初發(fā)現(xiàn)的3個(gè)家族成員GAI、RGA和SCR的特征字母命名［10］。目前已在擬南芥、水稻、葡萄、佛手、胡楊、枳、番茄、煙草等多種植物中發(fā)現(xiàn)GRAS家族基因，根據(jù)模式植物擬南芥和水稻基因組中的33個(gè)及57個(gè)GRAS家族成員可將GRAS家族分成8個(gè)分支，分別為：SCL3、SHR、PAT1、LISCL、DELLA、SCR、LS和HAM［11］。在植物中GRAS蛋白數(shù)量眾多，功能多樣，是許多重要生長(zhǎng)發(fā)育過程中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。近年來陸續(xù)報(bào)道關(guān)于GRAS家族蛋白在植物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，已成為研究的熱點(diǎn)。Torres-Galea等［12］檢測(cè)擬南芥PAT1分支AtSCL13表達(dá)模式時(shí)發(fā)現(xiàn)，在鹽、干旱、低溫等非生物脅迫及植物激素刺激下均能誘導(dǎo)表達(dá)AtSCL13；同屬PAT1分支的佛手GRAS基因，在低溫脅迫下其表達(dá)明顯上調(diào)［13］；徐凱等［14］從水稻中克隆了GRAS基因OsGRAS23，能提高轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)干旱脅迫的耐受性；從甘藍(lán)型油菜中分離的GRAS基因 BnLAS，能使轉(zhuǎn)基因植株葉片氣孔密度增加，同時(shí)增加了葉表面蠟質(zhì)的分泌，從而增強(qiáng)了植株對(duì)干旱的耐受性［15］；馬洪雙等［16］從胡楊中克隆了GRAS基因PeSCL7，該基因定位在細(xì)胞核中，并能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱和鹽的耐受性；山葡萄PAT1分支基因VaPAT1能夠同時(shí)提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)冷、干旱和鹽脅迫的耐受性［17］；剛毛檉柳GRAS基因啟動(dòng)子序列含有多個(gè)與逆境應(yīng)答有關(guān)的順式調(diào)控元件以及一些光響應(yīng)元件，可能在植物的逆境脅迫響應(yīng)和光響應(yīng)中起作用［18］。盡管GRAS家族參與植物抗逆功能的研究越來越多，但有關(guān)該家族基因啟動(dòng)子如何在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控鮮有報(bào)道。

鹽穗木（Halostachys caspica）是鹽生、旱生稀鹽多汁半灌木，生長(zhǎng)于荒漠地區(qū)鹽堿地、鹽湖邊及河岸，具有重要生態(tài)價(jià)值的鹽生植物［19-22］，成為研究鹽堿脅迫機(jī)制和進(jìn)行抗旱耐鹽堿脅迫基因及啟動(dòng)子克隆的理想材料。HcSCL13是鹽穗木中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有典型C端保守結(jié)構(gòu)域的GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族基因，隸屬該家族PAT1分支，與擬南芥AtSCL13同源性最高，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示HcSCL13基因在鹽脅迫條件下表達(dá)量顯著上升［23］，推測(cè)其可能在鹽穗木耐鹽機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)基于小組前期克隆獲得的鹽穗木HcSCL13基因全長(zhǎng)，設(shè)計(jì)特異性引物，采用染色體步移技術(shù)克隆獲得了該基因的啟動(dòng)子序列，使用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，同時(shí)構(gòu)建偶聯(lián)GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體 PHcSCL13∶GUS，通過GUS組織化學(xué)染色分析HcSCL13基因啟動(dòng)子的活性，旨在為研究HcSCL13基因參與鹽脅迫響應(yīng)的調(diào)控模式和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽穗木種子（Halostachys caspica Drob.）采自新疆103團(tuán)通古特沙漠。在溫室中于營(yíng)養(yǎng)土、珍珠巖和蛭石（2∶1∶1）的混合基質(zhì)中進(jìn)行種子萌發(fā)，平均培養(yǎng)溫度25℃，光照時(shí)間16 h/d，相對(duì)濕度40%。以生長(zhǎng)3個(gè)月左右的鹽穗木幼苗作為實(shí)驗(yàn)材料，提取基因組DNA。

野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）為Col生態(tài)型。擬南芥種子經(jīng)4℃春化2 d，次氯酸鈉表面消毒后，播種于1/2MS固體培養(yǎng)基上，8 d后將幼苗轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)約4周，花序浸染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

植物基因組提取試劑盒、PCR回收純化試劑盒、Taq DNA 聚合酶購(gòu)自TIANGEN公司；Genome Walking Kit試 劑 盒、Ex Taq酶、pMD18-T Vector、限制性內(nèi)切酶Hind III、Xba I購(gòu)自TaKaRa公司；In-Fusion HD Cloning Kit購(gòu)自Clontech公司；E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金公司；其它抗生素類均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 HcSCL13基因啟動(dòng)子克隆及其序列分析 稱取鹽穗木同化枝0.1 g，按照植物基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）說明書提取鹽穗木基因組DNA，基因組的濃度和純度用NanoDropTM分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

以鹽穗木基因組DNA為模板，根據(jù)TaKaRa公司Genome Walking Kit說明書，以HcSCL13 基因序列設(shè)計(jì)巢式PCR特異性引物SP1、SP2、SP3。首先以純化后的鹽穗木基因組DNA為模板，根據(jù)試劑盒PCR反應(yīng)體系，分別以試劑盒中提供的4種獨(dú)特簡(jiǎn)并引物AP1、AP2、AP3、AP4及HcSCL13基因特異性引物SP1進(jìn)行第一輪巢式PCR。再取第一輪巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物1 μL作為第二輪巢式PCR反應(yīng)的模板，上一輪對(duì)應(yīng)的簡(jiǎn)并引物為上游引物，SP2為下游引物，進(jìn)行第二輪巢式PCR。取第二輪巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物1 μL作為模板，再以上一輪對(duì)應(yīng)的簡(jiǎn)并引物為上游引物，SP3引物為下游引物，進(jìn)行第三輪巢式PCR，經(jīng)過三輪PCR得到HcSCL13基因上游的側(cè)翼序列。

使用PCR回收試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）對(duì)第三輪巢式 PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后挑取單克隆菌，菌液PCR驗(yàn)證后，送上海生物工程有限公司測(cè)序。利用DNAMAN對(duì)測(cè)序結(jié)果與HcSCL13 5' UTR區(qū)進(jìn)行比對(duì)，并根據(jù)拼接完好的啟動(dòng)子序列結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物，以鹽穗木基因組DNA 為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，從而進(jìn)一步驗(yàn)證克隆得到的啟動(dòng)子序列的正確性。采用PlantCARE在線分析軟件對(duì)克隆獲得的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其可能存在的順式作用元件。

1.2.2 植物表達(dá)載體PHcSCL13∶GUS 的構(gòu)建 為分析鹽穗木HcSCL13啟動(dòng)子的活性以及其時(shí)空表達(dá)特異性，用HcSCL13基因啟動(dòng)子PHcSCL13定向替換植物表達(dá)載體pBI121上啟動(dòng)GUS基因的35S啟動(dòng)子，使之與GUS基因融合，構(gòu)建如圖1所示。根據(jù)HcSCL13基因啟動(dòng)子的序列設(shè)計(jì)特異性引物，HcSCL13PGU1：5'-GATTACGCCAAGCTTGGGAACA TGACATGGATTACGA-3'（下劃線標(biāo)記為 Hind III酶切位點(diǎn)），HcSCL13PGU2：5'-CCGGGGATCCTCTAG ACCGAGAATAGCACAATCTGACTCTAT-3'（下劃線標(biāo)記為 Xba I 酶切位點(diǎn)）。

圖1 構(gòu)建HcSCL13基因啟動(dòng)子偶聯(lián)GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體示意圖

以測(cè)序正確含有鹽穗木HcSCL13啟動(dòng)子的克隆載體為模板，HcSCL13PGU1和HcSCL13PGU2為特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，使用限制性內(nèi)切酶 Hind III和 Xba I對(duì)植物表達(dá)載體pBI121進(jìn)行雙酶切，膠回收后，使用 In-Fusion HD Cloning Kit試劑盒對(duì)回收帶有酶切位點(diǎn)的啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物和酶切的載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，采用酶切鑒定和測(cè)序方法確定HcSCL13啟動(dòng)子是否已置換35S啟動(dòng)子，將成功構(gòu)建的重組載體命名為PHcSCL13∶GUS。

1.2.3 PHcSCL13∶GUS對(duì)擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及抗性苗篩選 將構(gòu)建正確的植物表達(dá)載體pBI121-PHcSCL13∶GUS采用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101，并挑取菌落進(jìn)行PCR 鑒定，陽性克隆用于擬南芥的轉(zhuǎn)化。采用農(nóng)桿菌花序浸染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，溫室培養(yǎng)收種。利用50 μg/mL卡那霉素篩選T0代轉(zhuǎn)PHcSCL13∶GUS陽性苗，單株收種。提取卡那霉素抗性擬南芥基因組DNA，進(jìn)行基因組PCR鑒定。

1.2.4 GUS活性組織染色分析 參照J(rèn)efferson等［24］方法測(cè)定T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS報(bào)告基因的表達(dá)情況。將待染色的外植體浸泡在GUS染色液（50 mmol/L磷酸鈉緩沖液、0.1% Triton X-100、1 mmol/L K3［Fe（CN）6］、1 mmol/L K4［Fe（CN）6］、1 mmol/L X-Gluc）中，置于37℃中保溫過夜，用75%乙醇沖洗脫色，直至底色完全消失，在體視鏡下拍照觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 HcSCL13基因啟動(dòng)子克隆

利用染色體步移技術(shù)的原理，通過簡(jiǎn)并引物AP3與設(shè)計(jì)的3條特異性引物進(jìn)行3輪巢式PCR反應(yīng)，得到一條長(zhǎng)約2 kb的啟動(dòng)子片段（圖2），回收該片段并連接至pMD18-T克隆載體上，通過序列測(cè)定和比對(duì)，該序列長(zhǎng)2 200 bp，且其3'端與HcSCL13基因序列的一致性達(dá)到了98%，說明擴(kuò)增得到的側(cè)翼序列是HcSCL13基因上游的啟動(dòng)子序列。

圖2 HcSCL13基因啟動(dòng)子的克隆

2.2 鹽穗木HcSCL13基因啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析

利用PlantCARE在線生物信息學(xué)軟件對(duì)所獲得的2 200 bp HcSCL13基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行相關(guān)預(yù)測(cè)分析。結(jié)果顯示克隆獲得的HcSCL13基因啟動(dòng)子區(qū)域不僅包含啟動(dòng)子區(qū)的核心元件CAAT-box和TATA-box，多個(gè)光響應(yīng)元件 GAG-motif、GA-motif、Box I和chs-CMA2a。還含有多個(gè)與逆境應(yīng)答有關(guān)的順式調(diào)控元件（圖3），如MBS、LTR、ERE、Box I、TCA-motif和TC-rich repeats等順式作用元件（表1）。

2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

使用Hind III和Xba I限制性內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒pBI121-PHcSCL13進(jìn)行雙酶切，得到與目的片段長(zhǎng)度一致的單一條帶，表明HcSCL13啟動(dòng)子已經(jīng)插入到pBI121載體中，構(gòu)建成功（圖4）。

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥抗性苗鑒定

通過花序浸染法將偶聯(lián)有GUS報(bào)告基因的HcSCL13啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入擬南芥，經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得20株抗性植株。以HcSCL13PGU1和HcSCL13PGU2為特異性引物對(duì)抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，部分結(jié)果如圖5所示，所檢測(cè)植株的擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期一致，表明抗性植株均含有HcSCL13啟動(dòng)子片段。

2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS的染色分析

以T1代PHcSCL13∶GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥為實(shí)驗(yàn)材料，將萌發(fā)生長(zhǎng)7 d和15 d的幼苗進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示（圖6），在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段轉(zhuǎn)PHcSCL13∶GUS基因T1代擬南芥幼苗的葉片和根部均檢測(cè)到GUS活性的藍(lán)色信號(hào)，而在非轉(zhuǎn)基因擬南芥的各個(gè)部位均未檢測(cè)到GUS活性，各組織未見染色，呈白色。

3 討論

GRAS作為植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于多種植物中。盡管目前已對(duì)該家族部分基因的功能開展了相關(guān)研究，但有關(guān)其調(diào)控機(jī)理的報(bào)道還很少。本研究利用基因組步移技術(shù)克隆獲得了鹽穗木GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子HcSCL13基因2 200 bp的啟動(dòng)子序列，與同源基因擬南芥AtSCL13啟動(dòng)子長(zhǎng)度近似（2 800 bp）。通過生物信息學(xué)對(duì)該啟動(dòng)子進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，含有如下順式作用元件：O2-site、GAG-motif、GA-motif、LTR、MBS、ARE、Box I、chs-CMA2a、TC-rich repeats、TCA-element、ERE、TATA-box和TCT-motif。其中，GAG-motif、GA-motif、Box I和chs-CMA2a、TCT-motif［25-27］為多個(gè)對(duì)光響應(yīng)的元件，是常見的受光調(diào)節(jié)啟動(dòng)子中的順式作用元件，能夠調(diào)節(jié)基因受光誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄活性。與已報(bào)道的擬南芥AtSCL13基因啟動(dòng)［28］子相似，推測(cè)其為受光誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，也可能參與了對(duì)植物光敏色素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

此外，HcSCL13作為積極響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄因子基因，在該啟動(dòng)子上還發(fā)現(xiàn)了與脅迫相關(guān)的一些順式作用元件，這些元件的非生物逆境應(yīng)答特性在以往的研究中已有較多的報(bào)道。LTR是與低溫脅迫相關(guān)的啟動(dòng)子調(diào)控序列［29］。MBS元件與干旱等多種非生物逆境脅迫相關(guān)，能夠作為反式作用因子MYB蛋白的結(jié)合位點(diǎn)［30，31］。ARE與厭氧應(yīng)答相關(guān)［32］。TC-rich repeats是植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫時(shí)響應(yīng)的元件，參與多種生物與非生物脅迫應(yīng)答［33］。TCA-element參與水楊酸反應(yīng)，該順式作用元件能在不同非生物脅迫下通過調(diào)控防御基因的表達(dá)，提高植物對(duì)脅迫的耐受性［34，35］。GCC box作為乙烯響應(yīng)元件ERE的保守序列，能夠調(diào)節(jié)植物對(duì)乙烯的響應(yīng)［36］。推測(cè)這些順式作用元件可能調(diào)節(jié)了HcSCL13 基因在鹽等逆境下的表達(dá)，進(jìn)而再通過 HcSCL13 所介導(dǎo)的信號(hào)路徑調(diào)節(jié)下游相關(guān)脅迫基因的表達(dá)以應(yīng)對(duì)各種非生物脅迫，從而表現(xiàn)出復(fù)雜的調(diào)控方式。

圖3 HcSCL13基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

通過對(duì)PHcSCL13∶GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥7 d和15 d兩個(gè)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的組織化學(xué)染色證明了HcSCL13啟動(dòng)子在非脅迫條件下能夠持續(xù)有效地啟動(dòng)下游GUS報(bào)告基因的表達(dá)，但是該啟動(dòng)子具有多個(gè)光響應(yīng)原件，在缺乏光照條件下能否啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，鹽等非生物脅迫是否會(huì)影響GUS活性也有待于深入研究。

4 結(jié)論

本研究獲得了鹽穗木轉(zhuǎn)錄因子HcSCL13基因的啟動(dòng)子，通過PantCARE在線軟件分析該啟動(dòng)子序列的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)了一些與光響應(yīng)、非生物脅迫（干旱、低溫）、激素（水楊酸、乙烯）、及逆境響應(yīng)的順式作用元件。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明該啟動(dòng)子具有活性。

表1 HcSCL13轉(zhuǎn)錄因子基因啟動(dòng)子核心作用元件

圖4 植物表達(dá)載體pBI121-PHcSCL13的酶切鑒定

圖5 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定

圖6 轉(zhuǎn)pBI121-HcSCL13：GUS擬南芥幼苗的GUS組織化學(xué)染色

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Activity Analysis of Promoter of GRAS Transcription Factor Gene HcSCL13 from Halostachys caspica

FAN Shou-de WANG Yan
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

In order to explore the expression characteristic and function of GRAS transcription factor gene HcSCL13 from Halostachys caspica，the 2 200 bp sequence of promoter was cloned using the genomic walking method. The analysis results using the PlantCARE software suggested that the promoter sequence contained not only the core elements such as CAAT-box and TATA-box，but also some cis-element related to the stress response. The 35S promoter sequence of the pBI121 expression vector was replaced by the HcSCL13 promoter sequence to construct the fusion expression vector. Then，the fusion expression vector was transformed into Arabidopsis thaliana by flora method and the T1 seedlings were stained by GUS. The results of GUS staining showed that the whole transformed A. thaliana seedlings were stained，indicating that the HcSCL13 gene promoter had expression activity，and it might be constitutive promoter.

transcription factor gene HcSCL13；genomic walking method；promoter cloning；analysis of cis-acting element and promoter activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.019

2016-09-26

國(guó)家青年自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31400729）

樊壽德，碩士研究生，研究方向：植物抗逆的生理生化與分子機(jī)制；E-mail：fanshoude123@163.com

王艷，博士，副教授，研究方向：植物抗逆的生理生化與分子機(jī)制；E-mail：wangyanxju@126.com