利用外源RNA作為內參結合qPCR準確檢測SF2蛋白RIP富集RNA的效率

李雨 趙磊 陳利 周宇荀 李凱 肖君華

（東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620）

利用外源RNA作為內參結合qPCR準確檢測SF2蛋白RIP富集RNA的效率

李雨 趙磊 陳利 周宇荀 李凱 肖君華

（東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620）

利用實時熒光定量PCR技術（Real-time Quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測0.1%甲醛交聯RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation，RIP）富集SF2蛋白相互作用的RNA效率，為研究可變剪接因子SF2相互作用RNA的富集效率提供準確的質檢方案。采用RIP技術獲取HeLa細胞中SF2蛋白相互作用的RNA，等比例加入外源釀酒酵母（BY4741）RNA，并以其β-actin作為內參基因，利用qPCR檢測RIP富集SF2蛋白相互作用RNA的效率。結果顯示，0.1%甲醛交聯RIP技術特異性捕獲得到SF2蛋白-RNA復合物；qPCR技術檢測陽性基因PABP、Srsf1在SF2抗體捕獲的產物和IgG抗體的產物中相應RNA的濃度差異均在60倍以上。利用qPCR技術，以外源釀酒酵母（BY4741）RNA作為內參，能快速、準確定量檢測RNA的富集效率。

甲醛交聯免疫共沉淀；內參基因；RNA富集；反轉錄實時熒光定量PCR

SF2蛋白（Serine/Arginine Splicing Factor 1）是富含絲氨酸、精氨酸SR（Serine/Arginine）蛋白家族的成員之一，作為剪切因子能夠促進剪接體的召集和前體mRNA的組成性剪接［1，2］。在人類基因組中，約有94%的前體mRNA可發生組成性剪接，可使同一前體mRNA分子產生不同剪接體，從而增加了基因表達的復雜性和蛋白的多樣性［3］。SF2蛋白作為多功能RNA結合蛋白廣泛參與mRNA轉錄后的調控［4］，包括mRNA初級體的剪接、出核、翻譯和降解等生物合成過程［5-9］。因此深入研究SF2蛋白相關RNA，對進一步揭示其生物學功能具有重要的意義。

RNA免疫共沉淀技術被廣泛應用于蛋白-RNA相互作用的研究［10，11］，將RNA免疫共沉淀技術與高通量測序技術相結合，能夠獲取與目的蛋白所結合RNA的信息［12］。然而，在已發表的279個CLIP數據集中，經過PCR重復之后有高達83.8%的CLIP-seq數據因捕獲的RNA特異性較差而被舍棄［13］。因此為提高CLIP數據的有效性，獲得低背景，高富集效率的RNA樣本，建立高效靈敏的質檢方法十分重要。捕獲的RNA樣本中，無法預測并篩選出穩定表達的基因作為內參基因，因此不能直接利用常規的qPCR進行目標RNA的定量檢測。目前常采用PCR結合瓊脂糖電泳技術的半定量方案檢測RNA是否捕獲［14］，但無法定量檢測RNA的富集效率以及非特異性RNA的富集情況。該質控無法精確預測文庫構建的質量，增加了實驗風險性。針對此問題我們提出可以在Srsf1抗體捕獲的產物和IgG抗體的產物中等比例引入外源釀酒酵母RNA，并以釀酒酵母RNA的β-actin作為定量內參進行qPCR檢測目標RNA的富集效率。針對引入外源RNA作為內參的方法，如Holstege等［15］采用生物素標記外源RNA的方法，檢測全基因組的表達水平；Kanno等［16］利用外源mRNA進行絕對定量，但未見在RIP富集效率檢測中利用酵母菌RNA作為內參的報道。

本研究針對RIP捕獲SF2蛋白相互作用的RNA為樣本，以釀酒酵母RNA的β-actin作為內參，采用qPCR技術精準定量檢測目標RNA的富集效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 HeLa細胞；釀酒酵母（BY4741）。

1.1.2 試劑及儀器 RNAiso Plus、Yeast RNAiso Kit試劑購自TaKaRa公司、逆轉錄試劑盒購自ThermoScientific公司、SuperReal PreMix SYBR Green購自 TIANGEN公司、高糖DMEM培養基購自美國Hyclone公司、胎牛血清購自美國Gibco公司、SF2抗體、normal IgG抗體均購自Santa cruz公司、Protein A+G Agarose、RIPA lysis buffer等蛋白相關試劑購自碧云天公司、蛋白酶抑制劑、RNA抑制劑均購自Thermo公司、引物則都由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成純化；非接觸式全自動破碎儀購自Diagenode公司、Nanodrop 2000c超微量分光光度計購自Thermo Fisher Scientific、實時熒光定量 PCR儀購自Applied Biosystems公司；其余常用化學試劑均購自國藥集團。

1.2 方法

1.2.1 酵母RNA的提取 采用RNAiso Plus、Yeast RNAiso Kit進行RNA抽提。以Nanodrop 2000c超微量分光光度計和0.1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質量和完整性，-80℃保存備用。

1.2.2 qPCR檢測外源釀酒酵母RNA 以Srsf1和PABP［17，18］做陽性參照（參考文獻已證明與SF2蛋白相互作用的RNA），PQLC1［17］作為陰性參照；qPCR采用SuperReal PreMix SYBR Green試劑盒，ABI 7500 real-time PCR system 和 7500 System Software-SDS 2.2（Applied Biosystems）分析RNA樣本，反應體系和反應條件依據說明書進行。

1.2.3 RIP得到SF2蛋白及其靶RNA 采用0.1%甲醛交聯免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）技術，獲取得到以下產物：（1）細胞裂解上清：總蛋白（Input-pr），總RNA（input-RNA）；（2）RIP上清蛋白（Unbounding-pr）；（3）RIP沉淀：SF2抗體特異性捕獲的SF2蛋白（SF2-ip-pr），RNA（SF2-ip-RNA），IgG抗體吸附的非特異性RNA（IgG-ip-RNA）。以Nanodrop 2000c超微量分光光度計和1% 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質量和完整性，-80℃保存備用。

1.2.4 SDS-PAGE、Western blot、考馬斯亮藍檢測目標蛋白SF2 Input-pr、Unbounding-pr、SF2-ip-pr蛋白樣品在12%的SDS-PAGE上分離得到兩個相同的SDS-PAGE膠，其一轉移至PVDF膜，一抗（鼠源）按1∶1 000稀釋比孵育過夜，用辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗室溫孵育1 h，利用ECL發光試劑盒顯色；其二浸沒在考馬斯亮藍試劑中染色1 h后用脫色液過夜脫色，均用Image Lab 4.1進行分析。

1.2.5 qPCR驗證ip-RNA的富集 SF2-ip-RNA、Ig-G-ip-RNA等比例加入外源釀酒酵母RNA。采用逆轉錄試劑盒逆轉錄cDNA，操作步驟依據說明書進行。以Srsf1和PABP做陽性參照，PQLC1作為陰性參照；qPCR采用SuperReal PreMix SYBR Green試劑盒，ABI 7900 real-time PCR system和7900 System Software-SDS 2.2（Applied Biosystems）分析SF2-ip-RNA和IgG-ip-RNA樣本，反應體系和反應條件依據說明書進行。

2 結果

2.1 外源釀酒酵母RNA中目標RNA表達量的檢測

無水乙醇、沒食子酸標準品、福林酚試劑、蘆丁標準品、DPPH、脫氧核糖、三氯乙酸、PBS、抗壞血酸、TPTZ均為分析純。

qPCR結果（圖1）顯示，HeLa細胞中的目標 RNA Srsf1、β-actin（Hela-actin）、PABP、PQLC1在HeLa細胞input樣本中高表達，在釀酒酵母中表達量和陰性結果保持一致；而外源酵母RNA中的β-actin（Teast-actin）在釀酒酵母RNA中高表達，在HeLa細胞中不表達。上述結果表明外源酵母RNA不干擾目的RNA的檢測。

圖1 HeLa內源RNA表達水平

2.2 SF2蛋白富集效率的檢測

Western blot檢測結果（圖2-A）顯示，ip-beads（ip蛋白和beads偶聯復合物）最亮，unbounding-pr樣品中沒有檢測到SF2蛋白；考馬斯染色檢測結果（圖2-B）顯示，SF2-ip-pr只檢測到一條蛋白，在inputpr總蛋白對應有相同條帶，unbounding-pr未檢測到該蛋白，成功捕獲單一目的蛋白。

圖2 Western印記檢測SF2蛋白（A）和考馬斯檢測總蛋白（B）

2.3 陽性基因富集效率的檢測

qPCR的檢測結果如表1，圖3所示，檢測得到陽性基因Srsf1和PABP在SF2陽性抗體和IgG陰性抗體產物中相差6個Ct值以上，濃度差異可達60倍以上；而陰性基因PQLC1只相差1.7個Ct值；且檢測基因的溶解曲線如圖3-B所示，檢測基因均為單一產物。

表1 富集RNA表達量

3 討論

目前研究蛋白-RNA相互作用的常用實驗方法是蛋白交聯免疫共沉淀結合高通量二代測序技術［19，20］。獲得低背景，高特異性，高富集效率的RNA樣本，可提高文庫構建的質量，降低實驗的風險性，顯著降低測序成本，極大地提高生物和技術的可重復性，并且可以使低豐度RNA結合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）和很少靶標RNA的RBPs的RBP位點更容易識別，精準的獲得與目標蛋白相互作用的RNA信息［21，22］。qPCR能夠高效靈敏檢測目的RNA的富集，而目的RNA是利用不同抗體（SF2特異性抗體和IgG陰性抗體）捕獲而得，無法篩選出像GAPDH等能夠穩定存在于捕獲產物中的基因作為內參，則不能利用qPCR進行相對定量檢測。因此引入外源RNA作為參考進行相對定量，可精準檢測捕獲的目的RNA的富集。

圖3 富集效率的檢測

本研究結果顯示，外源釀酒酵母RNA中未檢測出目標RNA，說明引入種屬差異大的外源RNA對于目的RNA的檢測沒有影響。同時對陽性基因富集效率的檢測，得到陽性基因Srsf1、PABP［17，18］在SF2陽性抗體和IgG陰性抗體產物中相對濃度差異可達60倍以上，而陰性基因PQLC1［17］只相差1.7個Ct值，相對濃度差異遠遠低于60倍，表明陽性參照Srsf1、PABP高效富集，說明基于0.1%甲醛交聯免疫共沉淀成功捕獲與SF2特異性相互作用的低背景RNA。因此，本研究方案引入外源RNA結合qPCR技術定量評估RIP富集RNA的質量，得到低背景，高特異性，高富集效率的RNA樣本，克服了半定量PCR結合瓊脂糖電泳技術無法精確定量檢測RNA富集效率及非特異性RNA富集情況的問題。

4 結論

本研究利用qPCR技術，以外源釀酒酵母（BY4741）RNA作為內參，能快速、準確定量檢測RIP-RNA的富集效率。對于改善提升RIP技術的應用具有明顯的價值。

［1］ Das S, Krainer AR. Emerging functions of SRSF1, splicing factor and oncoprotein, in RNA metabolism and cancer［J］. Molecular Cancer Research：MCR, 2014, 12（9）：1195-1204.

［2］ Long JC, Caceres JF. The SR protein family of splicing factors：master regulators of gene expression［J］. The Biochemical Journal, 2009, 417（1）：15-27.

［3］ Oltean S, Gammons M, Hulse R, et al. SRPK1 inhibition in vivo：modulation of VEGF splicing and potential treatment for multiple diseases［J］. Biochem Soc T, 2012, 40：831-835.

［4］ Sonenberg N, Hinnebusch AG. New modes of translational control in development, behavior, and disease［J］. Mol Cell, 2007, 28（5）：721-729.

［5］ Hastings ML, Krainer AR. Pre-mRNA splicing in the new millennium［J］. Curr Opin Cell Biol, 2001, 13（3）：302-309.

［6］ Ram O, Ast G. SR proteins：a foot on the exon before the transition from intron to exon definition［J］. Trends Genet, 2007, 23（1）：5-7.

［7］ Huang YQ, Steitz JA. SRprises along a messenger’s journey［J］. Mol Cell, 2005, 17（5）：613-615.

［8］ Sanford JR, Ellis JD, Cazalla D, et al. Reversible phosphorylation differentially affects nuclear and cytoplasmic functions of splicing factor 2/alternative splicing factor［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102（42）：15042-15047.

［9］ Sanford JR, Gray NK, Beckmann K, et al. A novel role for shuttling SR proteins in mRNA translation［J］. Gene Dev, 2004, 18（7）：755-768.

［10］ Tenenbaum SA, Carson CC, Lager PJ, et al. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays［J］. P Natl Acad Sci USA, 2000, 97（26）：14085-1490.

［11］ Gerstberger S, Hafner M, Tuschl T. A census of human RNA-binding proteins［J］. Nature Reviews Genetics, 2014, 15（12）：829-845.

［12］ Kishore S, Jaskiewicz L, Burger L, et al. A quantitative analysis of CLIP methods for identifying binding sites of RNA-binding proteins［J］. Nat Methods, 2011, 8（7）：559-564.

［13］ Van Nostrand EL, Pratt GA, Shishkin AA, et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP（eCLIP）［J］. Nature Methods, 2016, 13（6）：508-514.

［14］ Niranjanakumari S, Lasda E, Brazas R, et al. Reversible crosslinking combined with immunoprecipitation to study RNA-protein interactions in vivo［J］. Methods, 2002, 26（2002）：182-190.

［15］ Holstege FCP, Jennings EG, Wyrick JJ, et al. Dissecting the regulatory circuitry of a eukaryotic genome［J］. Cell, 1998, 95（5）：717-728.

［16］ Kanno J, Aisaki K, Igarashi K, et al. “Per cell”normalization method for mRNA measurement by quantitative PCR and microarrays［J］. BMC Genomics, 2006, 7：64-77.

［17］ Anczukow O, Akerman M, Clery A, et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer［J］. Mol Cell, 2015, 60（1）：105-117.

［18］ Sanford JR, Coutinho P, Hackett JA, et al. Identification of nuclear and cytoplasmic mRNA targets for the shuttling protein SF2/ ASF［J］. PLoS One, 2008, 3（10）：e3369.

［19］ Michalak P. RNA world-the dark matter of evolutionary genomics［J］. J Evol Biol, 2006, 19（6）：1768-1774.

［20］ Ule J, Jensen KB, Ruggiu M, et al. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain［J］. Science, 2003, 302（5648）：1212-1215.

［21］ Lebedeva S, Jens M, Theil K, et al. Transcriptome-wide analysis of regulatory interactions of the RNA-binding protein HuR［J］. Mol Cell, 2011, 43（3）：340-352.

［22］ Wu X, Chesoni S, Rondeau G, et al. Combinatorial mRNA binding by AUF1 and Argonaute 2 controls decay of selected target mRNAs［J］. Nucleic Acids Research, 2013, 41（4）：2644-2658.

（責任編輯 馬鑫）

Accurate Detection Efficiency of SF2 Protein RIP Enriching RNA Using Exogenous RNA as Reference Gene with qPCR

LI Yu ZHAO Lei CHEN Li ZHOU Yu-xun LI Kai XIAO Jun-hua
（Institute of Chemical and Biological Engineering，Donghua University，Shanghai 201620）

Using real-time quantitative polymerase chain reaction（qPCR）to detect the efficiency of SF2 enriching RNA based on 0.1% formaldehyde cross-linking RNA immunoprecipitation（RIP），we aim to provide an accurate detection method for studying the enriching efficiency of flexible splicing factor SF2 interacting with RNA. The RNA interacting with SF2 in HeLa cells was acquired with RIP，then RNA of exogenous yeast（BY474）in the same ratio was added，and the efficiency of RIP enriching RNA interacting with SF2 was measured via qPCR while using β-actin as reference gene. Results showed the RNA-SF2 protein complex was successfully obtained based on 0.1% formaldehyde cross-linking immunoprecipitation. The differences of RNA by positive genes（PABP，Srsf1）achieved 60 folds in SF2 and IgG samples via qPCR. Conclusively，qPCR combined with exogenous yeast（BY474）as reference gene may expeditiously and accurately quantify the RNA-enriched efficiency for SF2.

formaldehyde cross-linking immunoprecipitation；reference genes；RNA enriching；quantitative real-time reverse transcription PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.011

2016-10-10

國家自然科學基金面上項目（31371257），上海市科委關鍵項目（12140900404，13140900300，15140900500）

李雨，女，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：dhu.yuli@gmail.com

肖君華，男，教授，研究方向：醫學分子遺傳學；E-mail：xiaojunhua@dhu.edu.cn