響應(yīng)面法優(yōu)化木薯葉中黃酮類化合物的浸提條件

雍梁敏，劉暢，劉石生，*

（1.三亞學(xué)院，海南三亞572022；2.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228）

響應(yīng)面法優(yōu)化木薯葉中黃酮類化合物的浸提條件

雍梁敏1，2，劉暢2，劉石生2，*

（1.三亞學(xué)院，海南三亞572022；2.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228）

采用碳酸氫鈉浸提木薯葉中黃酮類化合物，并用NaNO2-Al（NO3）3比色法測定黃酮類化合物的含量。通過Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法對(duì)影響木薯葉浸提黃酮類化合物的主要因素進(jìn)行條件優(yōu)化。結(jié)果表明最優(yōu)條件為：加水量30.77 mL/g，浸提溫度79.65℃，浸提時(shí)間11.82 min，NaHCO3添加量0.03 g。在此工藝條件下浸提得到的黃酮類化合物含量為1 172.17 mg/100 g。

木薯葉；黃酮類化合物；碳酸氫鈉；響應(yīng)面

木薯（Manihot esculenta Crantz）又叫做樹薯、木番薯，地下部結(jié)薯，屬熱帶亞熱帶根莖作物，原產(chǎn)于亞馬遜河流域，是世界三大薯類（馬鈴薯、番薯、木薯）之一[1-2]。在我國，木薯廣泛栽培于廣西、海南、廣東、云南、福建、臺(tái)灣等省區(qū)[3]。目前，種植木薯主要是為了獲取其塊根，用來生產(chǎn)淀粉和酒精[4]，在國內(nèi)一般用作飼料，其價(jià)值沒有得到充分的重視。在亞馬遜叢林地區(qū)生活的印第安人傳統(tǒng)上把木薯葉作為一種草藥，烘干磨碎后制成葉粉，與其他草藥配合使用來治療某些疾病，療效顯著[5]。木薯葉中含有豐富黃酮類化合物，黃酮類化合物是一類具有多種保健功能的化合物，具有消除氧自由基、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、抗病毒等生理活性[6]。

Isao Kubo等研究了巴西的木薯品種maniva木薯葉中黃酮類化合物，用95%乙醇提取分析：100 g葉片含槲皮素84 mg、4，5，7-三羥黃酮醇84 mg、蘆丁462mg[4]。木薯葉中主要含有的黃酮類化合物為蘆丁，其屬維生素類藥，有降低毛細(xì)血管通透性和脆性的作用，保持及恢復(fù)毛細(xì)血管的正常彈性。用于防治高血壓腦溢血，糖尿病視網(wǎng)膜出血和出血性紫癜等，也用作食品抗氧劑和色素[7]。以往提取黃酮類化合物都是采用有機(jī)溶劑提取法，不利于食用。本文利用碳酸氫鈉對(duì)木薯葉中的黃酮類化合物進(jìn)行提取，優(yōu)選出最優(yōu)提取條件，以期拓寬木薯葉中黃酮類化合物在食品中的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

華農(nóng)8號(hào)木薯葉：采自中國熱帶科學(xué)院生物所文昌基地（海南），提取前先進(jìn)行冷凍粉碎等處理；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上海金穗生物科技有限公司。

723N可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

木薯葉中黃酮類成分為多酚化合物，因其結(jié)構(gòu)具有羥基，故可用堿性水或堿性稀醇液來對(duì)其中的黃酮類化合物進(jìn)行提取。本文采用碳酸氫鈉浸提木薯葉中黃酮類化合物，亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定黃酮類化合物的含量[8]。

1.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用碳酸氫鈉對(duì)木薯葉中的黃酮類化合物進(jìn)行浸提，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)為：加水量（10、20、30、40、50 mL/g），浸提溫度（50、60、70、80、90℃），浸提時(shí)間（6、8、10、12、14 min），NaHCO3添加量（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g）。

1.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法（RSA）優(yōu)化浸提工藝參數(shù)。其因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of the response surface tests

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)樣，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定黃酮類化合物的含量。

配置標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取25mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)于100mL容量瓶中，加熱溶解，放冷用60%乙醇定容（0.25 mg/ mL）。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液2、4、6、8、10 mL于50 mL容量瓶中，標(biāo)準(zhǔn)液濃度分別為：10、20、30、40、50 μg/mL，分別加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，再加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，再加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液，搖勻，放置15 min，60%乙醇定容在510 nm處比色，所得吸光度濃度曲線及回歸方程。得標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)蘆丁吸光度-濃度曲線Fig.1 Standard curve of rutin absorbance-concentration

得出回歸方程為：y=0.01x＋0.006 8，R2=0.998 31。

2.2 黃酮類化物浸提的單因素試驗(yàn)

2.2.1 加水量的選擇

在溫度為80℃，浸提時(shí)間為8 min，NaHCO3添加量為0.03 g的條件下，加水量不同，測得黃酮類化合物含量有所差別（圖2）。

圖2 加水量對(duì)黃酮類化合物浸提的影響Fig.2 Effect of water addition on flavonoids extraction

由圖2可看出，當(dāng)加水量為30 mL/g后隨著加水量的升高黃酮類化合物含量上升緩慢。說明開始時(shí)溶劑量大，溶劑中的有效成分濃度低，與物料及溶劑邊界層的有效成分濃度差大，擴(kuò)散推動(dòng)力大，因而提取率高，而到30 mL/g后，濃度差減少，提取率降低，考慮成本等因素，最優(yōu)加水量為30 mL/g左右為宜。

2.2.2 浸提溫度的選擇

在加水量為30 mL/g，浸提時(shí)間為8 min，NaHCO3添加量為0.03 g的條件下，溫度不同，測得黃酮類化合物含量有所差別（圖3）。

由圖3可知，隨著溫度的升高黃酮類化合物的含量呈先升后降的趨勢(shì)，在80℃時(shí)黃酮類化合物含量達(dá)到最大值。因此，浸提的最適溫度在80℃左右為宜。

2.2.3 浸提時(shí)間的選擇

在加水量為30 mL/g，浸提溫度為80℃，NaHCO3添加量為0.03 g的條件下，浸提時(shí)間不同，測得黃酮類化合物含量有所差別（圖4）。

圖3 溫度對(duì)黃酮類化合物浸提的影響Fig.3 Effect of temperature on flavonoids extraction

圖4 時(shí)間對(duì)黃酮化合物浸提的影響Fig.4 Effect of time on flavonoids extraction

由圖4可看出，當(dāng)浸提時(shí)間為12 min后，隨著時(shí)間的延長黃酮類化合物含量上升緩慢。說明提取初期，有效成分濃度差大，提取率增加明顯；當(dāng)達(dá)到12 min之后，溶劑中有效成分濃度增大，濃度差變小，隨著提取時(shí)間的繼續(xù)延長，提取率基本上不再增加。因此，浸提的時(shí)間選擇為12 min。

2.2.4 NaHCO3添加量的選擇

在加水量為30 mL/g，浸提時(shí)間為8 min，溫度為80℃的條件下，NaHCO3添加量不同，測得黃酮類化合物含量有所差別（圖5）。

圖5 NaHCO3添加量對(duì)黃酮類化合物浸提的影響Fig.5 Effect of NaHCO3addition on flavonoids extraction

由圖5可看出，隨著NaHCO3添加量的升高黃酮類化合物的含量呈先升后降的趨勢(shì)，在NaHCO3添加量為0.03 g時(shí)黃酮類化合物含量達(dá)到最大值。因此，最佳的NaHCO3添加量為0.03 g。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析及顯著性比較結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（n=5）Table 2 Designs and results of Box-Benhnken experimental（n=5）

表3 黃酮類化合物含量回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

續(xù)表3 黃酮類化合物含量回歸模型方差分析表Continue table 3 Variance analysis of regression equation

利用Design－expert8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，對(duì)各因素回歸擬合，得到黃酮類化合物含量Y的回歸方程Y=1 174.35+12.41A－0.48B－20.88C－9.60D－46.90AB+1.06AC+34.44AD－23.13BC+2.19BD－24.31CD+ 81.33A2－30.36B2－107.22C2－57.19D2。

同時(shí)，優(yōu)化4個(gè)影響因素的最佳組合為：加水量為30.77 mL/g，浸提溫度79.65℃，浸提時(shí)間11.82 min，NaHCO3添加量為0.03 g，預(yù)測的黃酮類化合物含量為1 175.96 mg/100 g。

由表3可以看出，所得Y的回歸方程極顯著，且失擬項(xiàng)不顯著，說明此模型很理想，用方程Y擬合4個(gè)因素與黃酮類化合物含量是可行的。相關(guān)系數(shù)R2= 0.998 6，表明回歸方程與實(shí)際數(shù)據(jù)間具有較好的擬合性；R2Adj=0.997 2，說明可信度較高。從因素A、B、C、D對(duì)黃酮類化合物含量的影響來看，除方程的一次項(xiàng)B影響不顯著外，其余因素影響均為極顯著。通過比較方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值大小，可以判斷因素影響的主次性，本試驗(yàn)中因素間影響順序依次為C＞A＞D＞B；交互項(xiàng)中除AC、BD影響不顯著外，其余因素間交互作用對(duì)黃酮類化合物含量均達(dá)到極顯著（P＜0.01）影響，且各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，而是呈二次關(guān)系。

分別將模型中A、B、C及D其中2個(gè)因素固定在0水平，得到另外2個(gè)因素間交互作用對(duì)黃酮類化合物含量Y的子模型，圖6～圖9為4個(gè)因素間部分兩兩交互作用對(duì)黃酮類化合物含量影響的響應(yīng)面分析圖。

圖6 時(shí)間和加水量對(duì)黃酮類化合物浸提量的影響Fig.6 Effect of time and water addition on flavonoids extraction

圖7 碳酸氫鈉添加量和加水量對(duì)黃酮類化合物浸提量的影響Fig.7 Effect of NaHCO3addition and water addition on flavonoids extraction

圖8 溫度和碳酸氫鈉含量對(duì)黃酮類化合物浸提量的影響Fig.8 Effect of temperature and NaHCO3addition on flavonoids extraction

圖9 時(shí)間和碳酸氫鈉添加量對(duì)黃酮類化合物浸提量的影響Fig.9 Effect of time and NaHCO3addition on flavonoids extraction

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在最佳浸提條件：加水量為30.77 mL/g，浸提溫度為79.65℃，浸提時(shí)間為11.82 min，NaHCO3添加量為0.03 g時(shí)進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，測得黃酮類化合物含量為1 172.17 mg/100 g，與預(yù)測值基本接近，表明預(yù)測值和真實(shí)值間有較好的擬合性，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。

3 結(jié)論

以華農(nóng)8號(hào)木薯葉為原料，利用NaHCO3浸提木薯葉中的黃酮類化合物，采用亞硝酸鈉－硝酸鋁比色法測定黃酮類化合物的含量。在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析，建立了黃酮類化合物含量與加水量、浸提溫度、浸提時(shí)間、NaHCO3添加量的二次多項(xiàng)回歸模型，其各因素的主要效應(yīng)關(guān)系為：C（浸提時(shí)間）＞A（加水量）＞D（NaHCO3添加量）＞B（浸提溫度），并確定了最佳浸提條件：加水量為30.77 mL/g，浸提溫度79.65℃，浸提時(shí)間11.82 min，NaHCO3添加量為0.03 g，此工藝條件下測得平均黃酮類化合物含量為1 172.17 mg/100 g，其與理論值間相對(duì)誤差為0.323%。

木薯葉中含有很多的植物生物活性物質(zhì)，是生產(chǎn)天然保健品的主要原料，且價(jià)格不菲，市場前景非常廣闊。但目前這方面的研究工作做的很少，很多有價(jià)值的有效成分未得到充分合理利用。因此采用NaHCO3浸提木薯葉中的黃酮類化合物對(duì)于將其用于食品中很有必要。

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Response Surface Methodology for Optimizing Extraction of Flavonoids from Cassava Leaves

YONG Liang-min1，2，LIU Chang2，LIU Shi-sheng2，*
（1.Sanya University，Sanya 572022，Hainan，China；2.College of Food，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Thispaperusedsodiumbicarbonatetoextractflavonoidsincassavaleaves，thenusedNaNO2-Al（NO3）3colorimetric to determine the content of flavonoids.Response surface methodology was successfully applied for optimization of the extraction condition of flavonoids compounds from cassava leaves.The actually maximum mean light transmittance could reach to 1 172.17 mg/100 g when additive amount of water was 30.77 mL/g，the treatment temperature was 79.65℃，the treatment time was 11.82 min and additive amount of NaHCO3was 0.03 g.

cassava leaves；flavonoids；sodium bicarbonate；response surface

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.014

2016－08－24

雍梁敏（1989—），男（漢），碩士研究生，研究方向：熱帶農(nóng)作物研究。

*通信作者：劉石生（1977—），男（漢），教授，博士研究生，研究方向：熱帶農(nóng)產(chǎn)品研究。