利用SSR和SFP標(biāo)記分析水稻葉色突變體的多態(tài)性

劉明浩，肖 楠，方希林，陳茜霖，吳旺嬪，陳光輝,2，王 悅

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

利用SSR和SFP標(biāo)記分析水稻葉色突變體的多態(tài)性

劉明浩1，肖 楠1，方希林1，陳茜霖1，吳旺嬪1，陳光輝1,2，王 悅1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

利用1 286對(duì)SSR標(biāo)記和66對(duì)SFP標(biāo)記對(duì)水稻轉(zhuǎn)綠型新葉黃化突變體ygr和正常綠葉水稻品種日本晴（NBP）的基因組進(jìn)行多態(tài)性研究。結(jié)果表明：1 236對(duì)SSR標(biāo)記和63對(duì)SFP標(biāo)記有擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增效率為96.08%；親本間共篩選到248對(duì)SSR多態(tài)標(biāo)記和12對(duì)SFP多態(tài)標(biāo)記，平均每條染色體有22對(duì)，多態(tài)檢出率為19.23%；多態(tài)標(biāo)記覆蓋水稻基因組達(dá)1 626.2 cM，相鄰多態(tài)標(biāo)記間平均遺傳距離為6.25 cM。不同類型標(biāo)記間比較發(fā)現(xiàn)，SSR標(biāo)記的多態(tài)檢出率比SFP標(biāo)記高1.1個(gè)百分點(diǎn)，兩者相差不大。

水稻；SSR標(biāo)記；SFP標(biāo)記；葉色；多態(tài)性

分子標(biāo)記技術(shù)在水稻功能基因定位、分子標(biāo)記輔助選擇育種以及遺傳多樣性分析等研究中具有重要作用。20世紀(jì)90年代以來(lái)，分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，水稻品種93-11 和日本晴測(cè)序的完成，加速了水稻分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。不同類型分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)對(duì)水稻功能基因的定位和克隆具有重要意義。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）也稱微衛(wèi)星標(biāo)記，覆蓋了水稻的整個(gè)基因組，具有數(shù)量多、高多態(tài)性、呈共顯性等優(yōu)點(diǎn)。Ouyang等[1]研究表明，水稻基因組含有18 828個(gè)SSR分子標(biāo)記。目前，這些SSR分子標(biāo)記在水稻功能基因圖位克隆和分子標(biāo)記輔助選擇育種的研究中得到廣泛應(yīng)用。SFP標(biāo)記（single feature polymorphism，SFP）是近年來(lái)開(kāi)發(fā)出來(lái)的一種基于微陣列技術(shù)的基因組插入/缺失差異標(biāo)記。Edwards等[2]根據(jù)基因組插入/缺失差異，開(kāi)發(fā)出880個(gè)SFP標(biāo)記，這些標(biāo)記也被廣泛用于水稻功能基因的研究中。

水稻產(chǎn)量的90%～95%來(lái)自光合作用，提高光能利用率，是發(fā)揮水稻產(chǎn)量潛力的重要途徑之一。葉色突變體是開(kāi)展水稻光合作用機(jī)制、葉綠體結(jié)構(gòu)功能及發(fā)育調(diào)控機(jī)理等基礎(chǔ)研究的理想材料。不斷發(fā)掘和鑒定新的尤其是實(shí)用型的水稻葉色突變基因，有助于在生產(chǎn)應(yīng)用中提高雜交水稻種子的生產(chǎn)質(zhì)量，進(jìn)一步揭示水稻光合作用分子機(jī)理。該研究旨在找出轉(zhuǎn)綠型新葉黃化突變體（ygr）和日本晴（NBP）親本間呈現(xiàn)多態(tài)性的分子標(biāo)記，比較SSR和SFP兩種標(biāo)記的多態(tài)檢出率，并探討多態(tài)性標(biāo)記的分布規(guī)律，以期為進(jìn)一步定位及克隆突變基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

轉(zhuǎn)綠型新葉黃化突變體ygr和正常綠葉品種NBP，均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 育 苗 供試的ygr和NBP種子，預(yù)先在37℃浸種（兩干兩濕），露白后，播種于塑料育秧盤(pán)中。育苗土為市面上購(gòu)買的營(yíng)養(yǎng)土，溫室育苗。

1.2.2 水稻基因組DNA的提取及PCR擴(kuò)增 水稻基因組DNA的提取參照McCouch的方法，略有改進(jìn)[3]。PCR擴(kuò)增體系（10 μL）：DNA 模板（20 ng/μL）1 μL，引物（2 pmol/μL）1 μL，10×Buffer 1 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.2 μL，rTaq酶（5 U/μL） 0.1 μL，ddH2O 6.7 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min：95℃變性30 s，55～58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min，4℃保存。電泳及檢測(cè)：在每管PCR產(chǎn)物中，加入2 μL Loading Buffer（指示劑）。以50 bp梯度的DNA Ladder為對(duì)照，以0.5×TBE為電泳緩沖液，150V恒壓電泳1.5～2.0 h，用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳分離。銀染程序根據(jù)Sanguinetti等[4]的方法改進(jìn)而成。

1.2.3 標(biāo)記來(lái)源 選擇均勻覆蓋水稻全基因組的1 286對(duì)SSR標(biāo)記和66對(duì)SFP標(biāo)記，檢測(cè)ygr和NBP之間的多態(tài)性。其中，SSR標(biāo)記及其序列信息來(lái)自McCouch、國(guó)際水稻基因組測(cè)序計(jì)劃等發(fā)表的文獻(xiàn)和Gramene數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.gramene.org/）[5]，SFP標(biāo)記的設(shè)計(jì)方法和序列信息參見(jiàn)Edwards等[2]發(fā)表的文獻(xiàn)。所有的標(biāo)記由上海英濰捷基生物公司和湖南華擎生物技術(shù)有限公司合成，-20℃保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用多態(tài)標(biāo)記檢測(cè)ygr和NBP親本間多態(tài)性，“1”代表同ygr相同的帶型，“2”代表同NBP相同的帶型，“-”代表帶型不清或缺失的帶型。連鎖圖譜采用MapDraw 2.1軟件繪制[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試SSR和SFP標(biāo)記在12 條染色體上的分布

在ygr和NBP親本間，共檢測(cè)1 352對(duì)分子標(biāo)記的多態(tài)性，其中SSR標(biāo)記有1 286對(duì)，SFP標(biāo)記有66 對(duì)，共覆蓋水稻全基因組1 857.6 cM，平均每條染色體約有113對(duì)。由表1可知，在水稻全基因組12條染色體上，6號(hào)染色體標(biāo)記分布最多，有133對(duì)，其次是3號(hào)染色體，有121對(duì)，而12 號(hào)染色體上的分子標(biāo)記最少，只有99對(duì)。所有染色體上，SSR標(biāo)記的擴(kuò)增率都在90%以上，而SFP標(biāo)記在3、5、8號(hào)染色體上的擴(kuò)增率均為83.33%，其他染色體上擴(kuò)增率為100%（表1）。

表1 SSR和SFP標(biāo)記在水稻12條染色體上的分布

2.2 SSR和SFP標(biāo)記多態(tài)性檢出率的比較

由表1可知，有260對(duì)分子標(biāo)記在ygr和NBP親本間呈現(xiàn)多態(tài)性。其中，SSR標(biāo)記有248對(duì)，SFP標(biāo)記有12對(duì)，平均每條染色體有22對(duì)多態(tài)標(biāo)記，多態(tài)檢出率為19.23%。不同染色體之間比較，6號(hào)染色體篩選得到的多態(tài)標(biāo)記最多，有34對(duì)；而7號(hào)染色體的多態(tài)性檢出率最高，達(dá)到26.61%。SSR標(biāo)記的多態(tài)檢出率為19.28%，而SFP標(biāo)記的多態(tài)檢出率為18.18%，兩者相差不大。

2.3 多態(tài)標(biāo)記在圖譜上的分布

以ygr和NBP親本間檢測(cè)到的220 對(duì)多態(tài)分子標(biāo)記構(gòu)建水稻多態(tài)圖譜如圖1所示，多態(tài)標(biāo)記覆蓋水稻全基因組1 626.2 cM，相鄰標(biāo)記間遺傳距離為6.25 cM。其中，3號(hào)染色體上多態(tài)標(biāo)記覆蓋距離最長(zhǎng)，達(dá)229.9 cM；第11染色體的平均間距最大，達(dá)到11.14 cM；6號(hào)染色體的多態(tài)標(biāo)記平均間距最小，為3.57 cM。此外，圖譜中尚有一些染色體位置多態(tài)標(biāo)記覆蓋不夠均勻，如2號(hào)染色體SSR標(biāo)記RM213至RM266之間相距41.7 cM，而3號(hào)染色體SSR標(biāo)記RM5548至RM85之間相距70.9 cM。這些相鄰標(biāo)記間距較大并不是因該染色體區(qū)段供試分子標(biāo)記密度或者間距過(guò)大造成的，如1號(hào)染色體SSR標(biāo)記RM582至RM5638之間37 cM區(qū)段內(nèi)供試分子標(biāo)記有26對(duì)，但是沒(méi)有在ygr與NBP親本間發(fā)現(xiàn)多態(tài)分子標(biāo)記，因此，在有大量供試分子標(biāo)記覆蓋的情況下，多態(tài)性可能與親本間基因組序列的同源性有關(guān)。

圖1 ygr與NBP親本間SSR和SFP標(biāo)記的多態(tài)圖譜

3 討 論

SSR標(biāo)記在水稻基因組內(nèi)的數(shù)量豐富，呈共顯性，而且在利用過(guò)程中，操作步驟少而簡(jiǎn)單，使其在構(gòu)建遺傳圖譜和分子標(biāo)記輔助選擇上，得到廣泛的應(yīng)用。鮑根良等[7]研究顯示，SSR多態(tài)性的檢出率，與親本的親緣關(guān)系呈正相關(guān)，即兩個(gè)品種的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，其多態(tài)的檢出率越高。因此，在構(gòu)圖遺傳圖譜時(shí)，應(yīng)該充分考慮兩個(gè)親本的親緣關(guān)系，最好選擇生態(tài)類型差異較大，或者親緣關(guān)系相差較遠(yuǎn)的兩個(gè)親本。該研究以轉(zhuǎn)綠型新葉黃化突變體ygr和正常綠葉品種NBP為親本構(gòu)建水稻多態(tài)圖譜，親本間多態(tài)性檢出率為19.23%，在包含260個(gè)多態(tài)標(biāo)記的水稻多態(tài)圖譜中，1、2號(hào)染色體上各有1個(gè)，3號(hào)染色體上有2個(gè)大于30 cM的區(qū)段存在。這可能與親本之間在染色體部分區(qū)段的同源性有關(guān)。

SFP標(biāo)記源于微陣列技術(shù)，是一種InDel標(biāo)記。黃玲等[8]研究表明，SFP標(biāo)記的擴(kuò)增率和多態(tài)率，均要高于SSR標(biāo)記，親本間的差異也要更加明顯。然而，該研究中SFP的多態(tài)檢出率為18.18%，略低于SSR的多態(tài)檢出率，這可能與親本間特異性相關(guān)。

隨著生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，多態(tài)性分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)效率不斷提高，高密度遺傳圖譜的構(gòu)建變得越來(lái)越容易，而且其相應(yīng)的成本也越來(lái)越低。利用生物信息學(xué)，綜合使用各種類型的標(biāo)記如SNP、Indel、ILP、STS、CAPS等，對(duì)靶區(qū)段進(jìn)行加密，將獲得更加理想的遺傳圖譜，從而縮短目標(biāo)基因（QTLs）的定位區(qū)間，為基因克隆奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1] Ouyang S，Liu J，Jones K M，et al. The map-based sequence of the rice genome[J]. Nature，2005，436：793-800.

[2] Edwards J D，Janda J，Megan T，et al. Development and evaluation of a high-throughput，low-cost genotyping platform based on oligonucleotide microarrays in rice [J]. Plant Methods，2008，4（1）：13.

[3] McCouch S R，Kochert G，Yu Z H，et al. Molecular mapping of rice chromosomes[J]. Theoretical and Applied Genetics，1988，76（6）：815-829.

[4] Sanguinetti C J，Dias N E，Simpson A J. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels[J]. Biotechniques，1994，17（5）：914.

[5] Mccouch S R，Teytelman L，Xu Y，et al. Development and mapping of 2240 new SSR markers for rice（Oryza sativa L.）[J]. DNA Research，2002，9（6）：199-207.

[6] 劉仁虎，孟金陵. MapDraw在Excel中繪制遺傳連鎖圖的宏[J]. 遺傳，2003，25（3）：317-321.

[7] 鮑根良，富田桂，小林麻子，等. 粳稻品種SSR多態(tài)性檢出率的分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（12）：2549-2554.

[8] 黃 玲，黃紅梅，肖應(yīng)輝，等. 利用SSR和SFP標(biāo)記分析不同抗瘟性水稻品種的多態(tài)性[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，36（3）：267-271.

（責(zé)任編輯：成 平）

Polymorphism Analysis of Rice Leaf Color Mutant by SSR and SFP Markers

LIU Ming-hao1，XIAO Nan1，F(xiàn)ANG Xi-lin1，CHEN Qian-lin1，WU Wang-pin1，CHEN Guang-hui1,2，WANG Yue1

（1.College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2.Collaborative Innovation Center of Paddy Crop and Oil Crops in Southern, Changsha 410128, PRC）

One thousand two hundred and eight six pairs of SSR markers and 66 pairs of SFP markers were used to find the genomic polymorphism between the new leaf yellowing mutant ygr and normal green leaf cultivar NBP. The results showed that 1 236 pairs of SSR markers and 63 pairs of SFP markers had amplification products and amplification efficiency was 96.08%. A total of 248 pairs of SSR polymorphic markers and 12 pairs of SFP polymorphic markers were screened. There were 22 pairs of polymorphic markers on each chromosome, and the polymorphism was 19.23%. Polymorphic markers covered 1 626.2 cM of the rice genome, and the average genetic distance was 6.25 cM between adjacent polymorphic markers. Compare by different types of markers, the polymorphism detection rate of SSR marker was higher than that of SFP marker by 1.1 percent point, with no significant difference.

rice; SSR markers; SFP markers; leaf color; polymorphism

Q343.1+7

A

1006-060X（2017）04-0001-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.004.001

2017-02-22

國(guó)家自然科學(xué)基金（31301650）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目（16B127）；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（XCX1549）

劉明浩（1989-），男，山東臨沂市人，碩士研究生，研究方向：水稻分子育種。

王 悅