DNAJC6異常過表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的進(jìn)展

耿蘊(yùn)峰，李曉娜，楊 紅，郝曉宏，韓淑琴，楊 濤*

(1.河北省石家莊市第一醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050011；2.河北省體育科學(xué)研究所門診部，河北 石家莊 050011)

·論 著·

DNAJC6異常過表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的進(jìn)展

耿蘊(yùn)峰1，李曉娜2，楊 紅1，郝曉宏1，韓淑琴1，楊 濤1*

(1.河北省石家莊市第一醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050011；2.河北省體育科學(xué)研究所門診部，河北 石家莊 050011)

目的分析熱休克蛋白家族成員C6(DNAJC6)表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌患者術(shù)后臨床資料的關(guān)系，探討DNAJC6在肝細(xì)胞肝癌中異常過表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞肝癌患者臨床分期的影響。方法選取術(shù)后病理為肝細(xì)胞肝癌的患者102例。應(yīng)用PCR檢測(cè)肝癌組織中DNAJC6mRNA的表達(dá)量，并與患者的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果腫瘤直徑≤2 cm患者DNAJC6mRNA高表達(dá)率低于腫瘤直徑>2 cm患者，肝癌分期Ⅰ～Ⅱ期患者DNAJC6mRNA高表達(dá)率低于肝癌分期Ⅲ期患者，肝癌分級(jí)為Ⅰ～Ⅱ級(jí)患者DNAJC6mRNA高表達(dá)率低于肝癌分級(jí)為Ⅲ級(jí)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同年齡、有無門靜脈癌栓、有無乙型病毒性肝炎患者間DNAJC6mRNA高表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論肝癌組織中DNAJC6異常過表達(dá)患者腫瘤直徑大、臨床分期及臨床分級(jí)差、預(yù)后不良，故DNAJC6可作為肝細(xì)胞肝癌患者術(shù)前病情及術(shù)后效果評(píng)估的重要指標(biāo)。

癌，肝細(xì)胞；熱休克蛋白質(zhì)類；腫瘤分期

肝細(xì)胞肝癌是最常見的人類惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在世界各類惡性腫瘤中居第5位，是惡性腫瘤致死的第三大原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)每年有約700 000人死于肝細(xì)胞肝癌，同時(shí)約有21 000個(gè)新診斷的病例。肝細(xì)胞肝癌已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅到人類健康的疾病，特別是在我國(guó)這樣乙型病毒性肝炎高發(fā)的國(guó)家，肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病率及病死率更是處于世界前列，成為威脅我國(guó)人民生命健康的主要惡性腫瘤之一[1-4]。目前對(duì)于肝細(xì)胞肝癌仍以外科手術(shù)切除為主要治療手段，但因患者病理分期不同，其術(shù)后效果差異巨大，故術(shù)前進(jìn)行有效的病情評(píng)估，對(duì)肝細(xì)胞肝癌患者至關(guān)重要。由于缺乏特異性的分子標(biāo)志物，使臨床醫(yī)師對(duì)肝細(xì)胞肝癌患者的評(píng)估手段局限于肝功能及影像學(xué)表現(xiàn)，從而使評(píng)估的準(zhǔn)確性受到了很大影響，因此找到一個(gè)特異性較強(qiáng)的分子標(biāo)記物作為肝細(xì)胞肝癌患者術(shù)前病情評(píng)估的輔助指標(biāo)，對(duì)提高術(shù)前評(píng)估的準(zhǔn)確性有著重要的臨床意義。熱休克蛋白家族成員C6(DNAJC6)，位于染色體1p31.3上65.37 Mb至65.67 Mb之間的區(qū)域。目前研究發(fā)現(xiàn)DNAJC6異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)病有關(guān)，其中包括帕金森病和精神發(fā)育遲滯癲癇等[5-6]。然而，有關(guān)DNAJC6在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中作用的報(bào)到有限，前期研究發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞肝癌組織中DNAJC6異常過表達(dá)，在人肝癌細(xì)胞中DNAJC6過表達(dá)可以通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變過程，增加肝癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力。DNAJC6在肝細(xì)胞肝癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用，DNAJC6異常過表達(dá)與腫瘤大小、分期、分級(jí)密切相關(guān)。因此，認(rèn)為DNAJC6可以作為輔助肝細(xì)胞肝癌患者臨床分期的一個(gè)重要的分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2003年2月—2008年12月于河北省石家莊市第一醫(yī)院接受肝癌手術(shù)的肝細(xì)胞肝癌患者102例，獲取手術(shù)切除的組織樣本。102例肝癌組織及30例相鄰正常肝組織標(biāo)本獲取后立即放入液氮中冷凍保存。回顧性分析102例肝癌切除術(shù)后患者的臨床資料。

本研究獲得河北省石家莊市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 臨床分組

1.2.1 年齡分組 患者年齡分組以55歲為界，小于55歲為低齡組，大于等于55歲為高齡組。

1.2.2 腫瘤直徑分組 患者腫瘤直徑分組以腫瘤直徑2 cm為界，直徑≤2 cm為小肝癌組，>2 cm為大肝癌組。

1.2.3 肝癌分期 以巴塞羅那臨床肝癌分期進(jìn)行分期：0期(極早期：PS評(píng)分0分、病灶為單發(fā)、腫瘤直徑≤2 cm、沒有門靜脈高壓)；A期(早期：PS評(píng)分0分、病灶為單發(fā)、腫瘤直徑任何大小、Child-Pugh A-B； PS評(píng)分0分、病灶數(shù)目3個(gè)以內(nèi)、腫瘤直徑≤3 cm、Child-Pugh A-B)；B期(中期：PS評(píng)分0分、病灶數(shù)目多發(fā)、腫瘤直徑任何大小、Child-Pugh A-B)；C期(進(jìn)展期：PS評(píng)分1～2分、病灶侵及門靜脈或N1、M1、腫瘤直徑任何大小、Child-Pugh A-B；終末期：PS評(píng)分3～4分、腫瘤直徑任何大小、Child-Pugh C)。本研究將研究對(duì)象分為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期，其中Ⅰ期為0期、Ⅱ期為A-B期、Ⅲ期為C期。

1.2.4 肝癌分級(jí) 以肝功能Child-Pugh分級(jí)對(duì)肝癌進(jìn)行分級(jí)：5～6分為A級(jí)，7～9分B級(jí)，10～15分C級(jí)。本研究將研究對(duì)象分為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期，其中Ⅰ期為A級(jí)、Ⅱ期為B級(jí)、Ⅲ期為C級(jí)。

1.2.5 門靜脈癌栓分組 根據(jù)患者有無門靜脈癌栓將患者分為有門靜脈癌栓組、無門靜脈癌栓組、無確切依據(jù)組。

1.2.6 乙型病毒性肝炎分組 根據(jù)患者有無乙型病毒性肝炎將患者分為陽性組、陰性組、臨床數(shù)據(jù)缺失組。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析肝癌組織及癌旁正常肝組織中DNAJC6mRNA的表達(dá)

1.3.1 提取肝癌組織及癌旁正常肝組織中總RNA 將組織樣本從液氮中取出，取樣本100 mg置于研缽中研磨至粉末狀，將研磨好的組織粉末中加入QIAzol Lysis Reagent700 μL研磨均勻，然后加入氯仿140 μL抽提、4 ℃離心，吸取上層水相加入100%乙醇1.5倍稀釋。吸取樣品700 μL加入RNeasy Mini RNA過濾柱中吸附RNA，漂洗及洗脫后加入RNase-free水50 μL離心獲取總RNA樣本，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 RT-PCR擴(kuò)增引物序列:5′-GGAATTCATGAGCCTCCTCGGGA-GCTAC-3′，5′-CCTCGAGATATAAGGGCTTTT-GGCCTTG-3′。內(nèi)參GAPDH序列:5′-GAAATC-CCATCACCATCTTCCAGG-3′，5′-GAGCCCC-AGCCTTCTCCATG-3′。PCR反應(yīng)條件如下：預(yù)變性階段95 ℃ 30 s；擴(kuò)增階段95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s。共行45個(gè)循環(huán)，收集30 s末熒光信號(hào)。qPCR實(shí)驗(yàn)基因表達(dá)值按照以下方式計(jì)算：ΔCt=Ct待測(cè)基因-Ct參照基因，基因相對(duì)表達(dá)值=2-ΔCt。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

腫瘤直徑≤2 cm患者DNAJC6mRNA高表達(dá)率低于腫瘤直徑>2 cm患者，肝癌分期Ⅰ～Ⅱ期患者DNAJC6mRNA高表達(dá)率低于肝癌分期Ⅲ期患者，肝癌分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)患者DNAJC6mRNA高表達(dá)率低于肝癌分級(jí)Ⅲ級(jí)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同年齡、有無門靜脈癌栓、有無乙型病毒性肝炎患者間DNAJC6mRNA高表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 102例肝細(xì)胞肝癌患者不同臨床病理因素DNAJC6表達(dá)比較Table 1 Comparison of the expression of DNAJC6 in 102 patients with hepatocellular carcinoma in different clinical pathological factors (例數(shù)，%)

3 討 論

當(dāng)今惡性腫瘤已成為威脅人類健康的首要疾病，是人類致死的主要病因。肝細(xì)胞肝癌是最常見的人類惡性腫瘤之一，還是惡性腫瘤致死的主要病種。乙型病毒性肝炎是肝細(xì)胞肝癌主要的致病因素，我國(guó)是乙型病毒性肝炎高發(fā)國(guó)家，故肝細(xì)胞肝癌在我國(guó)的發(fā)病率處于世界前列，嚴(yán)重威脅著我國(guó)人民的生命健康。

對(duì)于肝細(xì)胞肝癌，當(dāng)今仍以外科手術(shù)切除為主要治療手段，但是因患者病理分期及致病分子機(jī)制的不同，使患者術(shù)后的效果差異巨大，因此術(shù)前進(jìn)行有效的病情評(píng)估、術(shù)后進(jìn)行有效的分子生物治療對(duì)肝細(xì)胞肝癌患者有著重要的意義。現(xiàn)階段關(guān)于肝細(xì)胞肝癌發(fā)病的分子機(jī)制研究多種多樣：如早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子3(early growth response protein 3,EGR3)可通過對(duì)miR-718的負(fù)調(diào)控，使肝癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力增強(qiáng)[7]；組織因子途徑抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)能夠抑制肝癌細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)其凋亡[8]；肝細(xì)胞肝癌患者血清中miRNA-10b-3p表達(dá)水平明顯增高，并且其表達(dá)水平與患者的生存期明顯相關(guān)[9]；在肝癌細(xì)胞中miR-370表達(dá)減低，通過上調(diào)miR-370可激活A(yù)MPK/Sp1/DNMT1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的凋亡增加[10]；miR-147在肝癌組織及肝癌細(xì)胞中表達(dá)降低，在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-147發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力明顯降低[11]；磷脂酶Cε1 (phospholipase C epsilon-1,PLCE1)在肝細(xì)胞肝癌組織及肝癌細(xì)胞中低表達(dá)，并且其表達(dá)水平與肝癌預(yù)后指標(biāo)有負(fù)相關(guān)性[12]；薩爾樣蛋白4(Sal-like protein 4,SALL4)在肝癌組織中表達(dá)量明確高于癌旁正常肝組織，miR-33b在肝癌組織及肝癌細(xì)胞中表達(dá)降低，在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-33b發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力明顯降低，并且發(fā)現(xiàn)SALL4作為miR-33b的靶基因發(fā)揮作用[13-14]；Kruppel樣因子4(Kruppel-like factor 4,Klf4)通過調(diào)節(jié)miR-31表達(dá)影響肝癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力[15]； 在肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC7721中miR-146a可通過腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor-associated factor 6,TRAF6)影響肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力[16]；miR-221在肝癌組織中過表達(dá)，在肝癌細(xì)胞HepG2中抑制其表達(dá)，可明顯抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)[17]；MicroRNA-22-3p在肝癌組織及肝癌細(xì)胞中表達(dá)降低，在肝癌細(xì)胞HepG2中過表達(dá)MicroRNA-22-3p發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力明顯降低[18]。證實(shí)在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展過程中受到多種分子途徑的影響，為肝細(xì)胞肝癌的診斷及治療提供了一定的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。但是目前仍缺乏一種能夠準(zhǔn)確、系統(tǒng)評(píng)估肝細(xì)胞肝癌患者術(shù)前分期及術(shù)后效果的分子標(biāo)志物。為此，筆者選取102例肝細(xì)胞肝癌患者為研究對(duì)象，進(jìn)一步探討與肝細(xì)胞肝癌分期及術(shù)后評(píng)估相關(guān)的分子標(biāo)志物，最終發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中DNAJC6表達(dá)上調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中DNAJC6過表達(dá)可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯增強(qiáng)。

DNAJC6屬于進(jìn)化上保守的DnaJ/Hsp40家族的蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)分子伴侶活性從而刺激ATP酶活性。DnaJ蛋白可能有多達(dá)3個(gè)不同的領(lǐng)域：一個(gè)保守的70個(gè)氨基酸的J結(jié)構(gòu)域，通常在N末端，甘氨酸、苯丙氨酸(G/F)豐富的地區(qū)；一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域；富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域。到目前為止證實(shí)與DNAJC6相關(guān)的疾病包括帕金森病和精神發(fā)育遲滯癲癇。結(jié)合已得出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與102例患者的臨床病理數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤直徑≤2 cm患者DNAJC6mRNA高表達(dá)率低于腫瘤直徑>2 cm患者，肝癌分期Ⅰ～Ⅱ期患者DNAJC6mRNA高表達(dá)率低于肝癌分期Ⅲ期患者，肝癌分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)患者DNAJC6mRNA高表達(dá)率低于肝癌分級(jí)Ⅲ級(jí)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而不同年齡、有無門靜脈癌栓、有無乙型病毒性肝炎患者間DNAJC6mRNA高表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

綜上所述，肝癌組織中DNAJC6異常過表達(dá)的患者，其腫瘤直徑大、臨床分期及臨床分級(jí)差、預(yù)后不良。因此，DNAJC6可作為肝細(xì)胞肝癌患者術(shù)前病情及術(shù)后效果評(píng)估的重要指標(biāo)。

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(本文編輯：趙麗潔)

Overexpression of DNAJC6 promotes hepatocellular carcinoma

GENG Yun-feng1, LI Xiao-na2, YANG Hong1, HAO Xiao-hong1, HAN Shu-qin1， YANG Tao1*

(1.DepartmentofGeneralSurgery，theFirstHospitalofShijiazhuangCity，HebeiProvince，Shijiazhuang050011，China; 2.DepartmentofOutpatient，theSportsScienceInstituteofHebeiProvince，Shijiazhuang050011，China)

Objective To analyze the relationship between DNAJC6 expression and clinical data of patients with hepatocellular carcinoma(HCC), and to explore the effect of DNAJC6 overexpression on the clinical stages of HCC. Methods One hundred and two patients with hepatocellular carcinoma after operation were selected. PCR was used to detect the expression of DNAJC6mRNA in HCC tissues and analyzed with clinical data. Results The DNAJC6mRNA high expression in patients with tumor diameter≤2 cm was lower than that with tumor diameter>2 cm. The high expression rate of DNAJC6mRNA in HCC patients with stage Ⅰ to Ⅱ was lower than that in patients with stage Ⅲ. The high expression rate of DNAJC6mRNA in HCC patients with grade Ⅰ to Ⅱ was lower than that in patients with grade Ⅲ. The difference was statistically significant(P<0.05). There was no significant difference in the expression of DNAJC6mRNA between ages, portal vein tumor thrombus and hepatitis B virus(P>0.05). Conclusion DNAJC6 abnormal expression in hepatocellular carcinoma patients were with larger tumors, poor clinical stage, grade and prognosis, so DNAJC6 can be used as an important index to evaluate the preoperative condition and postoperative outcome in patients with hepatocellular carcinoma.

carcinoma, hepatocellular； heat-shock proteins; neoplasm staging

2017-01-17；

2017-03-27

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(16277705D)

耿蘊(yùn)峰(1980-)，男，河北石家莊人，河北省石家莊市第一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事肝膽外科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：yangtaopla@163.com

R735.7

A

1007-3205(2017)05-0548-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.05.012