普羅布考對小鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與機(jī)制

龔 淼，張 雷，趙春芳,李 莉，張亞楠,任廣偉

(1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 050031)

·論 著·

普羅布考對小鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與機(jī)制

龔 淼1，張 雷1，趙春芳1,李 莉1，張亞楠1,任廣偉2*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 050031)

目的探討普羅布考對小鼠腎缺血再灌注(I/R)損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法選取雄性10周齡C57BL/6j小鼠40只隨機(jī)分為4組各10只，分別為正常對照組、假手術(shù)組、I/R組、I/R+普羅布考灌胃組(100 mg/kg)。石蠟切片HE染色觀察小鼠腎臟形態(tài)學(xué)變化并進(jìn)行腎小管病理改變評分；生化法檢測小鼠血清肌酐(serum creatinine,SCr)和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平；比色法檢測腎組織中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)活性；Western blot法檢測腎組織GPX4蛋白表達(dá)。結(jié)果與正常對照組比較，IR組HE染色切片可觀察到腎組織損傷，SCr和BUN水平顯著升高，腎組織中MDA含量顯著增高，GPXs活性和GPX4蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與IR組比較，IR+普羅布考灌胃組腎組織損傷明顯減輕，SCr和BUN水平顯著降低，腎組織中MDA含量明顯降低，GPXs活性和GPX4蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。結(jié)論普羅布考能減輕小鼠腎組織因急性缺血再灌注引起的損傷，其機(jī)制可能通過上調(diào)GPX4活性發(fā)揮腎組織保護(hù)作用。

再灌注損傷；腎；普羅布考；小鼠

急性缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷是臨床上導(dǎo)致急性腎衰竭的常見原因之一[1]。近來研究發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的失活在腎I/R損傷中發(fā)揮重要作用，是引起腎小管上皮細(xì)胞死亡的主要原因[2-4]。由于腎臟是高血流灌注器官[5]，對缺血非常敏感，再灌注時過多的氧自由基更加重了腎組織的損傷[6]。普羅布考是曾廣泛應(yīng)用于臨床降低血脂的藥物，同時具有很強(qiáng)的抗氧化和抗炎的作用。研究表明普羅布考可以顯著降低組織或細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化水平，提高多種抗氧化酶活性，且不良反應(yīng)較小，只要停藥不良反應(yīng)隨即消失[7]。近年的研究已證實普羅布考預(yù)處理有效減輕心、腎等器官的I/R損傷，更加鞏固了其作為抗氧化藥物的臨床地位[8]。目前尚未見到關(guān)于普羅布考是否可以通過提高GPX4活性減輕腎組織I/R損傷的報道。本研究通過腎動脈夾閉方法建立小鼠腎I/R損傷模型，探討普羅布考后處理對小鼠I/R損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制，旨在為臨床選取恰當(dāng)?shù)慕M織保護(hù)藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 10周齡的清潔級C57BL/6j雄性小鼠40只(北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號:SCXK 京2009-0004)。兔抗GPX4單克隆抗體(sc-166120)、兔抗β-actin單克隆抗體(sc-58673)(Santa Cruz公司)，增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Abcam公司)，普羅布考、脂質(zhì)過氧化(malondialdehyde,MDA)試劑盒、GPXs活性檢測試劑盒(Sigma公司)，血肌酐(serum creatinine,SCr)檢測試劑盒、尿素氮檢測試劑盒(南京建成)。

1.2 實驗分組與I/R動物模型的建立 40只小鼠實驗分為4組：正常對照組(control)、假手術(shù)組(sham)、缺血再灌注組(I/R)、IR+普羅布考灌胃組(100 mg/kg)(I/R+probucol)，每組10只。參照Soares等[9]的方法建立小鼠腎臟I/R模型。戊巴比妥溶液腹腔注射進(jìn)行麻醉后，將小鼠呈仰臥位固定于37 ℃恒溫實驗臺上以維持體溫。腹部正中縱行切口暴露雙側(cè)腎臟，鈍性分離雙側(cè)腎蒂后用微型無創(chuàng)動脈夾夾閉40 min，待腎臟由鮮紅色變?yōu)榘导t色后松開動脈夾，恢復(fù)血流再灌注 24 h，待腎臟由暗紅變?yōu)轷r紅色后，造模完成。假手術(shù)組僅鈍性分離雙側(cè)腎蒂并穿線，不使用動脈夾夾閉腎蒂。I/R+普羅布考組小鼠在行造模手術(shù)后，給予100 mg/kg普羅布考灌胃2次/d，連續(xù)給藥3 d。造模72 h后，經(jīng)股動脈抽取動脈血，摘取雙側(cè)腎臟，一側(cè)快速放入液氮凍存?zhèn)溆茫粋?cè)固定進(jìn)行組織學(xué)檢測。

1.3 HE染色與腎組織病理評分 一側(cè)腎取材后立即放入4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片，切片脫蠟、梯度乙醇水合，蘇木精染液染色1～10 min、自來水沖洗5 min，1% 鹽酸酒精分化2～5 s、自來水沖洗2 min，5%氨水返藍(lán)30 s，伊紅染液染色1～3 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片。參照分級評分標(biāo)準(zhǔn)對腎臟病理變化進(jìn)行評價[10]，隨機(jī)選取10個400倍顯微鏡視野，對腎小管擴(kuò)張、腎小管上皮細(xì)胞脫落、腎小球結(jié)構(gòu)破壞、間質(zhì)充血與腎小管內(nèi)蛋白管型進(jìn)行半定量評價，對損傷陽性面積進(jìn)行評估，分級評分標(biāo)準(zhǔn)如下：<10%為0分；10%～25%為1分；>25%～50%為2分；>50%～75%為3分；>75%～100%為4分。

1.4 SCr和BUN水平檢測 再灌注24 h后，經(jīng)股動脈取動脈血放入離心管靜置30 min，離心后苦味酸速率法測定SCr含量，酶偶聯(lián)速率法測定BUN含量，所有步驟嚴(yán)格按照說明書順序，應(yīng)用全自動生化分析儀。

1.5 腎組織MDA含量與GPXs活性檢測 取一側(cè)腎組織冰上剪碎，加入預(yù)冷組織裂解液，離心后取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒方法進(jìn)行操作，分光光度計分別檢測MDA含量與GPXs活性。

1.6 Western blot檢測腎組織GPX4蛋白表達(dá) 取液氮凍存的小鼠腎組織，組織裂解液冰上裂解提取組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白上樣量均為40 μg，SDS-PAGE膠分離、轉(zhuǎn)膜、5%牛血清白蛋白(bull serum albumin,BSA)室溫封閉 1 h，去除封閉液后分別加入3%BSA稀釋的GPX4(1∶500)和β-actin(1∶1 000)抗體，4 ℃過夜，次日室溫平衡1 h后，加入辣根酶過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶200)，室溫孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色并顯影，應(yīng)用Quantity One定量分析條帶，以GPX4/β-actin比值表示GPX4的相對含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組腎臟組織病理學(xué)改變和腎組織損傷評分比較 與對照組比較，I/R組HE染色切片光鏡下可見腎組織損害，腎小管上皮變薄，腎小管管腔縮小，局部出現(xiàn)上皮細(xì)胞脫落，腎間質(zhì)紅細(xì)胞與白細(xì)胞增多，腎小管損傷評分明顯增高(P<0.01)；與I/R組比較，I/R+普羅布考組腎組織損害程度減輕，腎小管損傷評分明顯降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 普羅布考對腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(HE ×400)A.正常對照組；B.假手術(shù)組；C.I/R組；D.I/R+普羅布考灌胃組Figure 1 Effect of probucol on the renal tissue morphology (HE ×400)

表1 4組腎組織損傷評分比較Table 1 Comparison of renal injury score between 4 groups ，分)

*P<0.01與正常對照組比較 #P<0.05與I/R組比較(SNK-q檢驗)

2.2 4組SCr和BUN水平比較 與正常對照組比較，I/R組SCr和BUN含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與I/R組比較，I/R+普羅布考組SCr和BUN明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組SCr和BUN水平比較Table 2 Comparison of SCr and BUN levels between 4 groups

*P<0.01與正常對照組比較 #P<0.05與 I/R組比較(q檢驗)

2.3 4組腎組織MDA含量和GPXs活性比較 與正常對照組比較，I/R組腎組織MDA含量明顯升高，GPXs活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與I/R組比較，I/R+普羅布考組腎組織MDA含量明顯降低，GPXs活性明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組腎組織MDA含量和GPXs活性比較Table 3 Comparison of MDA content and GPXs activity in 4 groups

*P<0.01與正常對照組比較 #P<0.05與 I/R組比較(q檢驗)

2.4 GPX4蛋白在腎組織中的表達(dá) 與正常對照組比較，I/R組腎組織中GPX4蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；與I/R組比較，I/R+procubol組腎組織中GPX4蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 Western blot 檢測GPX4蛋白在小鼠腎組織中的表達(dá)
Figure2 The expression of GPX4 in mouse renal tissue detected by western blot

表4 普羅布考對腎組織GPX4蛋白表達(dá)的影響Table 4 Effect of probucol on the protein expression of GPX4 in renal tissue

*P<0.01與正常對照組比較 #P<0.05與I/R組比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

研究表明，腎作為高血流灌注的器官，缺血在40 min以內(nèi)造成的腎組織損傷是可逆的，缺血時間超過40 min可造成腎組織不可逆損傷[11]。目前，大部分研究側(cè)重于對腎組織可逆性I/R損傷的保護(hù)作用，而臨床更期望如何避免不可逆損傷或延長腎組織對缺血的耐受時間，并且臨床上I/R損傷的防治仍以藥物對癥治療為主[12]。本研究采用無創(chuàng)動脈夾阻斷腎臟血流40 min的方法建立小鼠急性I/R損傷模型，介于可逆損傷與不可逆損傷的中間狀態(tài)，通過腎臟顏色由鮮紅轉(zhuǎn)為暗紅再轉(zhuǎn)為鮮紅的大體結(jié)構(gòu)特征把握缺血與再灌注的時間間隔。同時采用術(shù)后給藥來模擬臨床無法進(jìn)行預(yù)處理的情況，于給藥3 d后取材，正好排除手術(shù)對腎功能造成的影響，有利于模型的有效性。本研究首先從腎組織的病理形態(tài)學(xué)入手，直觀觀察腎組織的損傷情況，并進(jìn)行分級評分。石蠟切片HE染色結(jié)果顯示，I/R組小鼠腎組織的損傷主要發(fā)生在皮質(zhì)與髓質(zhì)交界的部位，腎小管上皮細(xì)胞可見空泡變性，腎小管組織結(jié)構(gòu)因上皮細(xì)胞脫落呈現(xiàn)嚴(yán)重破壞，腎間質(zhì)內(nèi)可見彌漫性出血和中性粒細(xì)胞浸潤；而普羅布考治療組腎組織結(jié)構(gòu)完整，腎小管上皮細(xì)胞排列較整齊，邊界清晰，空泡變性少見，腎小管管腔未見明顯縮窄。表明普羅布考可以減輕小鼠腎I/R損傷，對腎組織具有保護(hù)作用。

臨床上，判斷腎組織受損情況的常用檢測方法是腎功能的檢查，常用指標(biāo)是SCr與BUN，SCr和BUN水平同時升高時提示出現(xiàn)腎組織損傷[13]。本研究結(jié)果顯示，模型建立后小鼠SCr和BUN水平較正常對照組明顯升高。提示模型可用于腎組織I/R損傷研究。由于單位時間內(nèi)通過腎臟進(jìn)行過濾的血液占心輸出量的25%左右，腎組織對缺血的敏感程度很高，缺血缺氧導(dǎo)致過量活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)作用于脂肪酸等生物大分子造成脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量MDA。因此，MDA也是腎組織損傷的指標(biāo)[14]。本研究結(jié)果顯示，腎I/R損傷組小鼠腎組織內(nèi)的MDA含量顯著升高。表明I/R引起腎組織脂質(zhì)過氧化。最新研究發(fā)現(xiàn)，I/R損傷引起腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化依賴的ferroptosis，是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，其主要機(jī)制是使GPX4失活，引起更多的脂質(zhì)過氧化物蓄積，加重組織損傷，同時敲除掉小鼠GPX4基因可以通過誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞死亡而導(dǎo)致急性腎衰竭，體內(nèi)實驗研究也發(fā)現(xiàn)應(yīng)用脂質(zhì)過氧化小分子抑制劑Liproxstain-1可以有效減輕腎組織損傷[3]。本研究結(jié)果顯示，腎I/R損傷模型小鼠的腎組織中MDA升高的同時伴隨GPXs活性的降低和GPX4表達(dá)的減少。說明GPX4在腎組織損傷中發(fā)揮作用，可以將GPX4作為藥物治療的靶點。

普羅布考最初是作為降脂藥物應(yīng)用于臨床，其抗氧化、抗炎與抗腫瘤活性逐漸被人們所認(rèn)識，曾經(jīng)因為不良反應(yīng)一度被新型降脂藥替代，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)普羅布考具有強(qiáng)大的抗氧化能力[15]。雖然有不少研究表明許多天然提取物通過抗氧化發(fā)揮較好的組織保護(hù)作用，但僅限于動物體內(nèi)外實驗，很少能直接用于臨床。普羅布考雖然具有可能導(dǎo)致心律失常的不良反應(yīng)，不過只對有嚴(yán)重心臟疾病的患者有此不良反應(yīng)，而且不良反應(yīng)會隨著停藥而消失，作為數(shù)十年應(yīng)用于臨床一線的藥物，隨時可以應(yīng)用于臨床治療[8]。目前，研究發(fā)現(xiàn)普羅布考的抗氧化作用主要是通過清除細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜上的自由基抑制脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，間接或直接激活細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶類，其中包括GPXs[16]。本研究結(jié)果顯示，普羅布考治療后，SCr和BUN明顯降低，腎組織內(nèi)MDA含量降低，而GPXs活性與GPX4蛋白表達(dá)顯著提高。提示普羅布考不僅可以通過直接抑制脂質(zhì)過氧化促進(jìn)腎組織損傷和功能的恢復(fù)，還可以通過提高GPXs活性加速清除過氧化物，特別是提高GPX4的活性，發(fā)揮組織保護(hù)作用。由于I/R是一個復(fù)雜的病理生理過程，普羅布考發(fā)揮其腎組織保護(hù)作用也不僅限于單純的抗氧化應(yīng)激，有可能是多靶點、多途徑的。普羅布考保護(hù)腎臟的機(jī)制尚未完全明了，需進(jìn)一步深入探討。

綜上所述，普羅布考處理對腎I/R損傷具有保護(hù)作用，可能是通過激活GPX4，直接或間接抑制脂質(zhì)過氧化達(dá)到腎組織保護(hù)作用。

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(本文編輯：劉斯靜)

Protective effect and mechanism of probucol on renal ischemia-reperfusion injury in mice

GONG Miao1, ZHANG Lei1, ZHAO Chun-fang1, LI Li1, ZHANG Ya-nan1, REN Guang-wei2*

(1.DepartmentofHistologyandEmbryology,theSchoolofBasicMedicalScience,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China; 2.DepartmentofNephrology,theFirstHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Objective To investigate the protective effect and mechanism of probucol on renal ischemia-reperfusion(I/R) injury in mice. Methods 10-week-old male C57BL/6j mice were randomly divided into four groups(n=10): control group, sham operation group, I/R group, and I/R+probucol(100 mg/kg) group. The renal tissue pathological changes were observed by HE staining and graded. Levels of SCr and BUN in serum were tested by ELISA. The content of MDA and activity of GPXs were detected by using chromometry. The protein expression of GPX4 was measured by western blot. Results Compared with control group, pathological changes of renal tissue were aggravated in IR group. SCr and BUN levels as well as MDA content of renal tissue were significantly increased. We also found that GPXs activity and GPX4 protein expression were significantly decreased(P<0.01). Compared with IR group, histopathological changes of renal tissue were alleviated in IR+probucol group. The levels of Cr and BUN were decreased significantly, with MDA content decreased and GPXs activity or GPX4 protein increased(P<0.05). Conclusion Probucol reduces the damage of renal tissue induced by acute ischemia reperfusion injury in mice, which might be involved in activating GPX4.

reperfusion injury； kidney； probucol； mice

2017-03-31；

2017-04-06

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題(20170517)

龔淼(1983-)，女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗師，醫(yī)學(xué)碩士，從事器官組織學(xué)研究。

*通訊作者。E-mail：55390309@qq.com

R619.9

A

1007-3205(2017)05-0497-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.05.001