例析稀釋涂布平板法計數微生物的易錯點

楊長奎　冉玲

2017年高考考試大綱新增了“微生物數量的測定”的內容。高中生物教材中有兩處涉及微生物數量需要測定，一處是必修3中“探究培養液中酵母菌種群數量的變化”，運用抽樣檢測法，在顯微鏡下觀察統計血球計數板上酵母菌數量并推算出培養液中酵母菌的個體數；另一處是選修1中“土壤中分解尿素的細菌的分離和計數”，運用稀釋涂布平板法，通過統計平板上的菌落數推測出樣品中活菌的大致個數。其中，稀釋涂布平板法計數微生物是考試的熱點，也是學生的易錯點。

1 易錯點一：用實驗組的平均菌落數與對照組菌落數的差值推算樣品中活菌個數

【例1】 空氣中的微生物在重力等作用下，可以一定程度的沉降。某研究小組欲用平板收集教室空氣中的微生物，以了解教室內不同高度空氣中微生物的分布情況。實驗步驟：① 配制培養基；② 制作無菌平板；③ 設置空白對照組和若干實驗組，進行相關操作；④ 將各組平板置于37 ℃恒溫箱中培養一段時間，統計各組平板上菌落的平均數。回答下列問題：

（1） 步驟③中，實驗組的操作是 。

（2） 若在某次調查中，某一實驗組平板上菌落平均數為36個/平板，而空白對照組的一個平板上出現了6個菌落，這種結果說明在此次調查中出現了

現象。若將30（即36-6）個/平板作為本組菌落數的平均值，該做法 （填“正確”或“不正確”）。

解析：本實驗的目的是了解教室內不同高度空氣中微生物的分布情況，應選擇不同的高度放置平板，實驗組的培養皿蓋應揭開，使之暴露在空氣中一段時間，以利于空氣中微生物沉降到平板培養基表面上。空白對照組的培養皿蓋不能打開，使之不接觸空氣，不應該出現菌落。若空白對照組平板出現了菌落，則說明空白對照組的平板被污染。對照組平板出現污染，實驗組平板不一定有污染或污染程度可能不一定與空白對照組的相同。所以，用實驗組獲取的菌落數的平均值減去污染產生的菌落數作為實驗的結果是不正確的。正確的做法是：在防止污染的情況下重新實驗，以獲得較準確的數據。

參考答案：（1） 將各實驗組平板分別放置在教室不同高度的位置上，開蓋暴露一段時間 （2） 污染 不正確

解題指南：用稀釋涂布平板法計數微生物，應設置空白對照實驗（跟實驗組唯一不同的是不接種或接種等量的無菌水），其目的是確定培養基制作是否合格。空白對照組如果出現了菌落，實驗組的數據不能用于計算樣品中的活菌數，也不能用實驗組的平均菌落數與空白對照組菌落數的差值來推算樣品中活菌個數。正確的做法是重新實驗，直到空白對照組沒有菌落出現為止。

2 易錯點二：用所有重復實驗組的平均菌落數來推算樣品中活菌個數

【例2】 圖1是從土壤中篩選產脲酶細菌的過程。

（1） 圖中選擇培養基應以 為唯一氮源；鑒別培養基還需添加 作指示劑，產脲酶細菌在該培養基上生長一段時間后，其菌落周圍的指示劑將變成 色。

（2） 在5個細菌培養基平板上，均接種稀釋倍數為105的土壤樣品溶液0.1 mL，培養一段時間后，平板上長出的細菌菌落數分別為13、156、462、178和191。每克土壤樣品中的細菌數量為 個；與血細胞計數板相比，此計數方法測得的細菌數目較 。

解析：脲酶能夠催化尿素分解為氨，要從土壤中篩選出產脲酶的細菌，需用以尿素作為唯一氮源的選擇培養基。尿素被分解成氨，會使培養基的堿性增強，pH升高，使酚紅指示劑變紅色。將稀釋倍數為105的土壤樣品溶液接種在細菌培養基平板上，用于計數細菌菌落數的方法是稀釋涂布平板法。統計的菌落數應介于30～300，所以，選擇細菌菌落數為156、178和191的平板計算出平均菌落數，即（156+178+191）÷3=175，每克土壤樣品中細菌數量為175÷0.1×105=1.75×108個。由于兩個或多個細菌連接在一起時，在平板上往往形成一個菌落，因此，統計的菌落數要少于樣品中活菌的實際值。

答案：（1） 尿素 酚紅 紅 （2） 1.75×108 少

解題指南：（1） 用稀釋涂布平板法計數細菌的原理是——當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統計平板上的菌落數就能推測出樣品中大約含有多少活菌。（2） 為增強實驗的說服力和保證準確的結果，要設置對照和重復實驗。設置空白對照，能排除培養基污染對實驗結果產生的影響。設置重復實驗（同一稀釋度涂布至少3個平板，一般設置3～5個平板），并且選擇菌落數在30～300的平板計算平均菌落數，再用平均菌落數推算樣品中活菌數。重復實驗可排除偶然因素對實驗結果的影響。如果重復實驗中某個平板的菌落數與其他差別甚遠，說明該平板操作過程有誤，應舍棄。若舍棄之后不足三個平板，如重復實驗組的平板菌落數為240、250、33，則不能用這三個平板的平均值來推算樣品中的活菌數，也不能用菌落數為240、250這兩個平板的平均值來推算樣品中的活菌數，而應找出原因并重新實驗。（3） 稀釋涂布平板法計數微生物的計算公式：每克樣品中的菌株數=（C÷V）×M，其中C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積，M代表稀釋倍數。樣品的稀釋流程是將10 g土樣加入到90 mL無菌水中得到稀釋10倍的樣液，從稀釋10倍的樣液中取1 mL加入到9 mL無菌水中得到稀釋100倍的樣液，如此進行梯度稀釋。