蜂糧中芽孢桿菌的分離鑒定及其耐酸耐高糖特性的分析

張言周， 王 爽， 李韻雅， 蔡宇杰， 廖祥儒

（江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

蜂糧中芽孢桿菌的分離鑒定及其耐酸耐高糖特性的分析

張言周， 王 爽， 李韻雅， 蔡宇杰， 廖祥儒*

（江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

為豐富人工發酵蜂花粉生產蜂糧的菌種資源，從天然蜂糧中篩選芽孢桿菌。通過平板涂布法從中蜂蜂糧樣品中分離產芽孢的細菌，利用16S rRNA基因同源比對及系統發育分析對其進行初步鑒定，并分析其耐酸耐高糖特性。共分離到16株隸屬于Bacillus tequilensis、Bacillus aerophilus、Fictibacillus nanhaiensis、Bacillus sonorensis、Lysinibacillus xylanilyticus、Lysinibacillus fusiformis、Bacillus invictus、Bacillusmethylotrophicus的芽孢桿菌。其中10株菌能在低酸和高糖條件下正常生長，菌株Br7、Br9和Br11的芽孢生成量較少，有潛力應用于人工發酵蜂花粉制備蜂糧。

芽孢桿菌；蜂糧；蜂花粉

蜂糧作為一種純天然的發酵食品，營養豐富，風味獨特，目前已經成為一種極具開發前景的保健食品，具有抗疲勞、美容保健、增強免疫力和記憶力等生理功能[1]。蜂糧也稱蜂巢花粉，是雄蜂和工蜂的主要營養供給，是蜂花粉經過一系列復雜的過程轉化而成，包括蜂花粉的采集、乳糜狀花粉團的調制以及花粉團的微生物發酵釀制[2-3]。其中花粉團的微生物發酵釀制是蜂糧形成的關鍵，也是影響蜂糧品質的決定因素，蜂糧具有復雜的微生物系統[4-5]。天然蜂糧僅能在蜂巢中由微生物發酵產生，產量有限，而且又是蜂群幼蟲的食物，大量采取會對蜂群的繁殖產生嚴重影響，因此天然蜂糧至今無法在市場上大規模的銷售[1]。

為了滿足蜂糧的巨大市場需求，眾多研究者試圖利用從天然蜂糧中分離的關鍵微生物發酵蜂花粉來實現蜂糧的規模化生產，這就需要全面分析蜂糧發酵中的微生物組成及變化。天然蜂糧是一個復雜的微生物體系，從中已分離到多種微生物，包括乳酸菌、酵母菌、霉菌以及芽孢桿菌等。過去對巢房中蜂糧發酵過程中微生物活動的分析表明：第一階段為乳酸菌、酵母菌以及某些好氧細菌利用花粉中豐富的營養物質大量繁殖；第二階段厭氧乳酸菌（如鏈球菌）利用酵母菌產生的生長素生長繁殖，引起花粉團的pH降低并產生B族維生素；第三階段，乳鏈球菌消失，能產更多酸的乳酸桿菌開始生長；第四階段由于積累的乳酸濃度過高，從而抑制了乳酸菌和酵母菌的生長，乳酸菌和某些酵母菌開始消失。此時蜂花粉pH接近4，蜂糧釀制完成[6-7]。但這一過程中并未見到芽孢桿菌活動情況的分析，而在成熟蜂糧中已有不少芽孢桿菌被分離到，例如，Gilliam等（1989）從杏仁花粉、蜂花粉和1、3、6周蜂糧樣品中分離到芽孢桿菌屬的6種芽孢桿菌41個菌落[8]。其中，枯草芽孢桿菌是蜂糧中常見的細菌，可能是蜜蜂在酸制過程中添加到蜂糧中的[6，9]。

在人工生產蜂糧的探索中，主要是應用從天然蜂糧中篩選的乳酸菌或酵母菌來發酵蜂花粉[10-12]。與天然蜂糧的發酵相比，微生物菌種過于單一，無論是營養以及風味均與天然蜂糧相去甚遠。尤其是天然蜂糧中的芽孢桿菌，其在蜂糧的發酵釀制中可能發揮著重要作用。但是，尚沒有將芽孢桿菌應用到人工發酵蜂花粉的實踐中。同時，為提高人工發酵蜂糧的品質，除了常用的乳酸菌及酵母菌，需要篩選更加豐富的菌種應用到蜂糧的人工發酵中，而天然蜂糧中豐富的芽孢桿菌將是不錯的選擇。因此，作者將從采自廣西某蜂場的中蜂蜂糧中篩選芽孢桿菌，并對篩選到的芽孢桿菌進行初步的分子鑒定，分析其系統發育關系。并對這些芽孢桿菌的耐酸、耐高糖特點及低酸高糖條件下芽孢的生成進行了分析，為人工發酵蜂花粉生產蜂糧奠定豐富的芽孢桿菌菌種資源，對于蜂花粉的深加工及蜂糧制品的開發具有重要的實踐意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 蜂糧樣品 采自廣西巴馬某蜂場的蜂巢，蜂種為東方蜜蜂（中蜂，Apiscerana cerana），采收季節為秋季。采收的蜂糧樣品置于預先準備的無菌樣品瓶，于室溫條件下放置于陰涼通風處。

1.1.2 培養基 營養肉湯培養基（NB）：牛肉膏5 g；蛋白胨10 g；氯化鈉5 g；pH 7.0~7.2；NB瓊脂培養基：牛肉膏 5 g；蛋白胨 10 g；氯化鈉 5 g；瓊脂 20 g；pH 7.0~7.2；耐高糖檢驗培養基：含葡萄糖的NB培養基，葡萄糖質量分數分別為20%，30%，40%，50%；耐酸檢驗培養基：不同pH值的營養肉湯培養基，pH分別為4.5、4.0、3.5；種子培養基：營養肉湯培養基。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種篩選 稱取2 g蜂糧樣品，用滅菌生理鹽水稀釋到質量分數75%，取200μL稀釋液涂布在營養肉湯瓊脂培養基上，于超凈工作臺靜置30 min后30℃倒置培養48 h。挑取合適尺寸的菌落，通過劃線分離純化單菌落，轉接并保藏菌種[13]。

1.2.2 產芽孢菌株的鑒定 將保存的菌株用NB瓊脂培養基培養至48 h，挑取少許菌落進行革蘭氏染色和芽孢染色，顯微鏡下觀察染色結果并確定有無芽孢的產生。

1.2.3 菌株16S rRNA基因擴增 利用NB培養基過夜培養保存的菌株，收集菌體，利用生工細菌基因組提取試劑盒提取菌株基因組DNA，以引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492R：5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′為上下游引物，通過PCR擴增各菌株的16S rRNA基因[14]。PCR反應體系為：DNA模板 2μL、10×PCR Buffer 5μL、2.5 mM dNTP 4μL、10μM上下游引物各2μL、Taq酶

2μL，雙蒸水35μL。PCR反應條件為：95℃5min，94℃30 s，55℃40 s，72℃90 s，72℃5min，32個循環。取5μL PCR產物電泳檢測，其余產物純化后與克隆載體pMD 18T載體相連，轉入大腸桿菌JM109中并送往上海生工進行測序。

1.2.4 系統發育樹的構建 將各菌株16S rRNA基因測序數據在NCBI網站進行BLASTN比對，檢索同源序列，并用 MEGA 4.0.2軟件采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）進行系統進化樹的構建，以確定菌種在進化中的位置。并將各菌株的16S rRNA基因序列數據提交到GenBank數據庫。

1.2.5 菌株耐高糖特性的檢驗 由于天然蜂糧混有蜂蜜，且經發酵之后其含糖量較高，所以其含有的原生菌株應該在發酵過程中能夠忍耐高濃度糖的脅迫。因此，用含不同濃度葡萄糖的NB培養基檢驗各菌株耐高糖特性，記錄各菌株在不同糖濃度的培養基中培養24 h后的菌體濃度（以培養液在600 nm的吸光值表示）。以過夜培養的各菌株為種子液，以體積分數2%接種量轉接入不同糖濃度的3 mLNB培養基中培養24 h。

1.2.6 菌株耐酸性檢驗 由于天然蜂糧發酵中最明顯的變化就是蜂花粉pH的降低，因此用不同pH的NB培養基檢驗各菌株的生長極限pH。以過夜培養的各菌株為種子液，以體積分數2%接種量轉接入不同pH的3mL NB培養基中培養24 h，記錄各菌株的菌體濃度 （以培養液在600 nm的吸光值表示）。

1.2.7 菌株在低酸高糖條件下形成芽孢的特性主要考察各菌株在低酸高糖（pH 4.0，30%糖質量分數）條件下培養24 h形成芽孢的情況，因為在酸性和高滲透壓（高糖濃度引起）條件下，芽孢桿菌會通過形成芽孢以耐受低酸高糖的脅迫，但芽孢是休眠體，無法作用于蜂糧的發酵。因此，只有那些在低酸高糖條件下能正常生長，芽孢生成量較小的菌株才有可能在蜂糧的發酵中發揮作用。芽孢生成量的測定采用分光光度法測定芽孢中的吡啶二羧酸（DPA）的含量進行，芽孢量用單位質量菌體DPA含量的多少表示即每毫克菌體干質量含有多少微克（μg）DPA[15]。測定原理是芽孢在萌芽、水解，或加熱過程釋放DPA。利用二價鐵離子和DPA形成的復合物形成的顏色，在440 nm有吸收，對芽孢進行檢測。但這種復合物不穩定，可加入還原劑如抗壞血酸可使復合物穩定2 h。其變色范圍在pH 4.0～6.0。芽孢中DPA的釋放采用121℃高溫高壓滅菌的方法進行[16]。

2 結果與分析

2.1 16S rRNA基因擴增與測序

經革蘭氏染色和芽孢染色檢驗，共從蜂糧樣品中篩選到16株產芽孢的細菌，編號為Br1-16。對這16株菌的16S rRNA基因進行了PCR擴增，利用1 g/dL瓊脂糖凝膠對PCR產物進行了電泳分析，大小如圖1所示，16株菌的擴增序列條帶大小介于1 000于1 500 bp之間。對這16個PCR產物進行了測序，得到的序列已提交至GenBank數據庫，序列號如表1所示。

圖1 分離自蜂糧的產芽孢細菌16S rRNA基因PCR擴增產物電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of 16S rRNA genes from spore-form ing bacteria isolated from bee bread

2.2 16S rRNA基因同源性比對及系統發育分析

利用BLASTN將16株細菌的16S rRNA基因序列與數據庫中的序列進行比對，序列同源性達大于98%的模式菌，將是判斷16株細菌歸屬的重要依據。如表1所示，菌株Br1，Br6和Br11的16S rRNA基因均與模式菌 Bacillus tequilensis KCTC 13622T的同源性大于99%，但系統發育分析（圖2）表明這3株菌是不同的，菌株Br11比Br1和Br6與模式菌有著更近的系統發育關系。與另外13株菌相比，這3株菌與枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis NCIB 3610T）有著較近的系統發育關系。菌株Br2、Br3、Br10與模式菌株 Bacillus aerophilus 28KT的16S rRNA基因相似度均大于99%，但只有菌株Br10與模式菌處在同一系統進化樹分支上（圖2）。盡管同源比對表明菌株 Br12與模式菌 Bacillus invictus Bi.FFUP1T有著較高的同源性，但系統發育分析顯示Br12與模式菌Bacillus aerophilus 28KT可能有著更近的發育關系。

表1 分離自蜂糧的產芽孢細菌16S rRNA基因序列同源性比對結果Table 1 Homologous analyses of 16S rRNA gene sequences of spore-form ing bacteria isolated from bee bread

圖2 蜂糧中產芽孢細菌的系統發育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the spore-form ing bacteria isolated from bee bread

16S rRNA基因同源比對分析表明，菌株Br7、Br9和 Br13與模式菌 Lysinibacillus xylanilyticus XDB9T同源性均在99%左右，Br8和Br14與模式菌Lysinibacillus fusiformis NBRC 15717T的同源性約為99%。但是，系統發育分析表明，菌株Br13與非模式菌Lysinibacillus fusiformis R6有著更近的系統發育關系。Br7和Br9處在同一個系統進化樹分支上，Br8和Br14也處在同一分支上，它們極有可能是來自于同一株菌的不同菌落，這需要通過以后的生理生化實驗去驗證。相似的情況也出現在菌株Br15和 Br16上， 它們均與模式菌 Bacillus methylotrophicus CBMB205T有著大于 99%的 16S rRNA基因相似度。最后，同源比對及系統發育分析均表明菌株 Br4和 Br5分別與模式 Fictibacillus nanhaiensis JSM 082006T和 Bacillus sonorensis NBRC 101234T有著相同的歸屬關系。

通過以上的分析表明，從蜂糧樣品中分離到的16株能形成芽孢的細菌均是芽孢桿菌，這16株芽孢桿菌隸屬于8個不同的種，這需要生理生化鑒定去進一步驗證。

2.3 菌株耐高糖特性

如表2所示，16株菌在含不同濃度葡萄糖的NB培養基中的生長情況用培養物在600 nm的吸光值表示。與不含葡萄糖時相比，質量分數20%的葡萄糖不同程度地促進了16株芽孢桿菌的生長。當葡萄糖質量分數升高至30%時，16株菌的生長明顯受到抑制。當葡萄糖質量分數繼續升高至40%時，共有5株菌 （Br6、Br10、Br11、Br12、Br15）的OD600低于1，而菌株Br7和Br9生長受到抑制的較輕。在50%的糖濃度下，16株芽孢桿菌均不能生長。

表2 分離自蜂糧的芽孢桿菌在不同濃度葡萄糖下的生長差異Table 2 Grow th difference of Bacillus strains isolated from bee bread under different glucoseconcentration

菌株 葡萄糖質量分數/% 0 20 30 40 50 Br11 2.13 2.87 1.65 0.87 -Br12 2.72 3.24 1.98 0.74 -Br13 3.65 4.75 2.34 1.54 -Br14 4.17 5.12 3.15 1.87 -Br15 1.52 2.68 1.02 0.97 -Br16 4.82 5.66 3.87 2.46 -

2.4 菌株耐酸特性

如表3所示，16株芽孢桿菌在不同pH條件下的生長差異用培養物在600 nm的吸光值表示。菌株Br8、Br13和Br14在pH4.5的條件下完全不能生長，當pH值降低至4.0時菌株Br3、Br10和Br12的生長也完全被抑制。當pH繼續降低至3.0時，只有Br2、Br7、Br9和Br11生長的較好。而Br4、Br5和Br6 3株菌在pH 3.0時，其培養物在600 nm的吸光值均小于1。

表3 分離自蜂糧的芽孢桿菌在不同pH條件下的生長差異Table 3 Grow th difference of Bacillus strains isolatedfrom bee bread under pH 4.5，4.0 and 3.5

2.5 菌株在低酸高糖條件下形成芽孢的特性

天然蜂糧的酸度一般在pH 4.0左右，糖質量分數一般在30%左右，所以選擇在pH 4.0和30%糖質量分數的條件下，考察10個菌株在培養24 h后芽孢生成量的差異，芽孢量的差異以每毫克菌體干重中所含DPA量的差異表示。如圖3所示，菌株Br7、Br9和Br11在培養24 h后生成的芽孢量遠小于其它菌株，菌株Br4和Br15生成的芽孢量最多。

圖3 10株芽孢桿菌在低酸（pH 4.0）高糖（30%）條件下培養24 h后形成芽孢量的差異Fig.3 Difference of spore production of ten Bacillus strains cultured for 24 h under pH 4.0 and 30% of glucose

3 結語

從采自廣西某蜂場的中蜂蜂糧中共篩選到16株產芽孢的細菌，經16S rRNA基因同源比對及系統發育分析，這 16株菌分別隸屬于 Bacillus tequilensis、 Bacillus aerophilus、 Fictibacillus nanhaiensis、 Bacillus sonorensis、 Lysinibacillus xylanilyticus、 Lysinibacillus fusiformis、 Bacillus invictus、Bacillusmethylotrophicus。通過對16株菌的耐高糖及耐酸特性的對比，結合天然蜂糧低酸高糖的特點，共挑選出10株菌檢驗其在pH4.0和30%糖濃度的條件下生成芽孢量的差異。結果表明菌株Br7、Br9和Br11在低酸高糖的條件下芽孢生成量較低，因此，作者認為這3株菌可能在天然蜂糧的發酵中發揮著重要作用，它們將作為候選菌株用于蜂花粉的人工模擬發酵。下一步的重點將是考察它們的安全性及探索其應用于蜂花粉發酵的條件。

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Isolation and Identification of Bacillus Strains From Bee Bread and Their Tolerance to Acid and G lucose

ZHANG Yanzhou， WANG Shuang， LIYunya， CAIYujie， LIAO Xiangru*
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

Bacillus strainswere isolated from natural bee bread to enrich m icrobes producing bee bread from the fermentation of bee pollen.Strains were isolated based on the homologous alignmentusing spread platemethodandprelim inaryidentified using phylogenetic analysis of the 16S rRNA genes.Theirtolerance to acidand glucosewas also discussed.Sixteen spore-form ing bacteria were totally isolated from bee bread of Apissinensis and identified as the genus of Bacillus tequilensis，Bacillus aerophilus，Fictibacillusnanhaiensis，Bacillus sonorensis，Lysinibacillusxylanilyticus，Lysinibacillusfusiformis，Bacillus invictus and Bacillus methylotrophicus，respectively. However，only ten Bacillus strains could grow vigorously at low pH （4.0）w ith high glucose concentration（30%）.Fewer spores were produced by the strain Br7，Br9 and Br11，which were suggested as the potentialstrainsused forartificial fermentation ofbee pollen.

Bacillus，bee bread，bee pollen

Q 81

A

1673—1689（2017）04—0410—06

2015-04-27

江蘇省產學研前瞻項目（BY2014023-28）；無錫市科技發展農業支撐項目（CLE01N1310）；中央高校基本科研業務費專項資金資助項目。

*通信作者：廖祥儒（1964—），男，江西南康人，教授，博士研究生導師，主要從事資源微生物的篩選及工業應用研究。

E-mail：liaoxiangru@163.com

張言周，王爽，李韻雅，等.蜂糧中芽孢桿菌的分離鑒定及其耐酸耐高糖特性的分析[J].食品與生物技術學報，2017，36（04）：

410-415.