pH響應型透明質酸-棉酚納米粒子的制備及其性能研究

施 瑜， 王麗娟， 徐珊珊， 劉 瀟， 許菲格，張曼悅， 朱棟琪， 陳荊曉， 陳敬華

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫214122）

pH響應型透明質酸-棉酚納米粒子的制備及其性能研究

施 瑜， 王麗娟， 徐珊珊， 劉 瀟， 許菲格，張曼悅， 朱棟琪， 陳荊曉， 陳敬華*

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫214122）

制備了基于硼酸酯鍵的pH響應型透明質酸-棉酚綴合物，用于治療前列腺癌。其在水溶液中可自組裝形成納米粒子，透射電鏡觀測表明其平均粒徑40 nm，可均勻分散。體外藥物釋放實驗證明，其具有pH響應的釋藥行為。體外細胞毒性結果顯示其對前列腺癌細胞的半數抑制濃度（IC50）較正常細胞低，表現出治療靶向性。該納米粒子在棉酚的靶向傳遞及前列腺癌治療方面具有一定的應用潛力。

pH響應；硼酸酯鍵；棉酚；納米粒子；細胞毒性

前列腺癌是常見的老年男性癌癥，隨著人口老齡化其發病率日趨增高[1-2]。棉酚（Gossypol，GP）這種常用作避孕藥的天然化合物可直接作用于前列腺，具有抑制前列腺癌細胞增殖、促其凋亡的作用[3-4]。不過，棉酚水溶性不佳，且不具有選擇性易產生副作用而應用受限。由于腫瘤組織具有pH偏低的性質，用具有pH響應功能的納米藥物傳遞系統能提高疏水性藥物的生物利用度，同時改善其靶向治療效果[5]。因而，構建新型pH敏感藥物傳遞系統受到研究人員的關注。

有研究表明，苯硼酸在pH大于其pKa時，可與具有二醇結構的化合物結合形成硼酸酯鍵，當介質pH小于pKa時，硼酸酯鍵則會斷裂，表現出pH響應行為[6-8]。由于GP分子具有鄰二醇基團，可利用其與苯硼酸形成硼酸酯鍵，制備受pH調控的GP藥物傳遞系統。透明質酸（Hyaluronic acid，HA）作為天然大分子，其生物相容性良好并可特異性識別腫瘤細胞表面過量表達的CD44受體[9-11]，因此可構建基于HA的藥物傳遞系統來改善GP的生物相容性并提高其腫瘤靶向性。

作者擬在透明質酸分子上連接氨基苯硼酸（3-aminophenylboronic acid，APBA），得到衍生物HP，之后通過硼酸酯鍵與GP連接，制備具有兩親性的HGP綴合物（如圖1）。期望HGP在水溶液中能自組裝形成納米粒子，并利用HA可特異性識別腫瘤細胞表面過量表達CD44受體以及硼酸酯鍵的pH響應性質，實現GP的靶向傳遞和控制釋放。

圖1 HGP的合成路線Fig.1 Synthetic route of HGP

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棉酚由江南大學藥學院湯魯宏教授贈予；HA（M w 5 000）：購自山東福瑞達醫藥集團公司；APBA：購自上海安耐吉化學有限公司；噻唑藍（MTT），N，N’-二異丙基碳二亞胺（DIC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）：購自上海晶純試劑有限公司；透析袋、胰酶：購自Sigma-Aldrich公司；青霉素-鏈霉素，RPMI 1640，DMEM 細胞培養基：自 Life Technologies公司；胎牛血清（FBS）：購自Hyclone公司；其它試劑均為分析純，使用前純化。

1.2 主要儀器

Avance III型核磁共振波譜儀：德國Bruker公司產品；JEM-2100透射電鏡：日本JEOL公司產品；Zetasizer Nano ZS電位及粒度分析儀：英國Malvern公司產品；Multiskan GO酶標儀：美國Thermo公司產品。

1.3 菌株與細胞株

人前列腺癌細胞（PC-3），非洲綠猴SV40轉化的腎細胞（COS7）：購自中國科學院保藏中心（上海）。

1.4 實驗方法

1.4.1 HP的制備 將100 mg的HA（0.248 mmol雙糖單元）溶于10 mL新蒸甲酰胺中，加入0.12mLDIC（0.75 mmol，3 eq）和87.5 mg NHS（0.75 mmol，3 eq），于冰浴下活化羧基2 h，之后將50mg APBA（0.38mmol，1.5 eq）加入上述溶液，氮氣保護下反應48 h。反應結束后，用V（醋酸緩沖溶液）∶V（甲醇）= 1∶1透析2 d，之后用去離子水透析2 d，冷凍干燥得HP。產物通過核磁共振氫譜（1H NMR）確認結構。

1.4.2 HGP的制備 稱取50 mg的HP溶于5 mL PBS（pH 7.4），將2mLGP的甲酰胺溶液 （10mg/ mL）緩慢滴加入上述溶液，并于室溫下攪拌6 h。反應結束后用V（PBS）∶V（甲醇）=1∶1透析1 d，之后用PBS（pH 7.4）透析1 d，冷凍干燥得HGP。產物通過核磁共振氫譜（1H-NMR）確認結構，并根據GP標曲測定其含量。GP質量分數（%）=（mGP/mHGP）×100%。1.4.3 HGP納米粒子的制備及表征 將HGP溶于PBS（pH 7.4，1 mg/mL）中，于25℃下靜置1 h，待納米粒子形成并穩定后測定其粒徑分布和ζ-電位，并通過透射電子顯微鏡觀測其形貌。

1.4.4 體外藥物釋放實驗 采用透析法測定GP的釋放行為，將2mL HGP（1 mg/mL）溶液裝入透析袋中，然后分別浸入裝有10mL不同pH（pH 5.0和pH 7.4）的緩沖溶液中，放入搖床，37℃條件下于預設時間取樣，同時補充新鮮緩沖液。用紫外分光光度計于368 nm處測樣品紫外吸收，并根據GP標曲計算累積釋放率，每組實驗3個平行。藥物累積釋放率（%）=（Mt/M）×100（Mt為t時刻GP的累積釋放量；M為HGP中GP總質量）

1.4.5 體外細胞毒性實驗 PC-3細胞用含質量分數10%FBS、1%雙抗的RPMI 1640細胞培養基，COS7細胞用含質量分數 10%FBS、1%雙抗的DMEM細胞培養基，在37℃下，含體積分數5% CO2及飽和濕度的培養箱中培養。

待細胞長滿后，按8 000個/孔的細胞密度，將細胞接種于96孔板同時培養過夜。之后棄去培養基，將不同濃度的HP、HGP、GP（溶于含質量分數10%FBS的細胞培養基中，其中GP用質量分數5%的DMSO助溶）溶液加入孔板中，并預留只含10% FBS的細胞培養基作為空白對照。繼續培養48 h后每孔加入0.5mg/mLMTT溶液100μL，37℃培養4 h，吸出上清液，用100μL DMSO溶解沉淀物，采用酶標儀于570 nm處檢測OD值。細胞存活率（%）=（OD加藥組/OD空白組）×100

2 結果與分析

2.1 HGP的合成

HP以及HGP的化學結構通過核磁共振氫譜進行確認，結果如圖2所示。從HP的核磁圖譜可以看出，在7.3×10-6~8.0×10-6處出現了APBA苯環上氫的峰，這說明APBA成功與HA相連，并且通過其與2.1×10-6處的N-乙酰氨基葡萄糖單元上甲基氫峰面積比較，算出APBA的取代度為28%。另外，HGP的核磁圖譜在10.2×10-6處出現了GP醛基上氫的峰，同樣通過其與2.1×10-6處的N-乙酰氨基葡萄糖單元上甲基氫峰面積比較，可以算出GP的取代度為10%。此外通過368 nm處GP的標曲計算得到的GP質量分數為11.2%，與積分計算所得結果相吻合。

圖2 HP（a）與HGP（b）在D2O/CD3OD（體積比為1/1）中的核磁共振氫譜Fig.21H NMR spectra of HP（A）and HGP（B）in D2O/ CD3OD（1/1）

2.2 納米粒子的表征

將疏水性藥物GP連接于HA親水性骨架上，得到的HGP具有兩親性，因而其在水溶液中能夠自組裝形成納米粒子。通過透射電鏡觀察其形貌（圖3），所形成的納米粒子均勻分散，具有球形結構，粒徑約為40 nm。此外，通過動態光散射測定納米粒子在水溶液中的粒徑分布及ζ-電位（如圖4），其平均粒徑為60.5 nm，比由電鏡觀測得到的粒徑略大，這主要是因為電鏡觀察的納米粒子是在干燥狀態下，因而尺寸略小。另外測得的ζ-電位值為-13.6 mv，這說明該納米粒子具有良好的穩定性。

圖3 HGP納米粒子的透射電鏡圖Fig.3 TEM image of HGP nanoparticles

圖4 HGP納米粒子的粒徑分布及ζ-電位Fig.4 Size distribution andξ-potential of HGP nanoparticles

2.3 體外藥物釋放

HGP在pH 7.4和pH 5.0條件下的藥物釋放結果如圖5所示。在pH 5.0條件下，GP具有較快的釋放速率，在開始4 h內可達32%，12 h后累積釋放量為60%。而在pH 7.4條件下，GP釋放緩慢，12 h內的積累釋放量僅有24.2%，3 d后也只達到了28.5%。這主要是因為在pH 5.0環境下，硼酸酯鍵不穩定，GP與HA的結合發生破壞，隨即導致納米粒子解離，加快了藥物的釋放。這一結果證明了HGP受pH調控，可在酸性環境下實現GP的刺激-響應釋放。

圖5 HGP在pH 7.4和pH 5.0環境下的體外藥物釋放（n=3）Fig.5 In vitro drug release profiles of HGP at pH 7.4 and pH 5.0（n=3）

2.4 HP和HGP的細胞毒性

通過MTT法測定HP對PC-3細胞和COS7細胞的細胞毒性，結果如圖6所示。HP對PC-3細胞和COS7細胞均沒有表現出明顯的細胞毒性，當HP濃度達到300mg/L的情況下，細胞存活率依然維持在80%左右。這一結果說明HP維持了HA良好的生物相容性，可以作為GP的載體用于傳遞藥物。

圖6 HP對PC-3細胞和COS7細胞48 h的體外細胞毒性（n=6）Fig.6 In vitro cytotoxicity of HP against PC-3 and COS7 cells after 48 h（n=6）

GP和HGP的細胞毒性同樣通過MTT法測定，結果如圖7所示，GP對PC-3細胞和COS7細胞均有較大的毒性，其半數致死量分別為18.9 mg/L和22.9mg/L。這一結果證明了GP不具有治療的特異性，單獨使用易對正常細胞產生副作用，降低其治療效果。形成納米粒子之后，HGP對PC-3細胞和COS7細胞的半數致死量分別為21.3 mg/L和45.0 mg/L。這是因為HA能夠靶向識別PC-3細胞表面過度表達的CD44受體，此外當HGP進入腫瘤細胞后，較低的pH會破壞其硼酸酯鍵并釋放出藥物，因此HGP能夠保持對PC-3細胞較高的抑制作用。而HA缺乏對COS7細胞的靶向選擇性，同時HGP在COS7細胞中能夠保持穩定，GP不會快速泄漏釋放，所以HGP對COS7細胞的毒性較小。

圖7 GP與HGP對PC-3細胞（a）和COS7（b）細胞48 h的體外細胞毒性（n=6）Fig.7 In vitro cytotoxicity of GP and HGP against PC-3cells and COS7 cells（n=6）after 48 h

3 結語

基于硼酸酯鍵制備了兩親性HGP綴合物，其在水溶液中能夠自組裝形成納米粒子，并且表現出pH響應性，能夠在pH 5.0的環境下快速釋放藥物。HA的腫瘤靶向性提高了HGP的治療選擇性，腫瘤細胞低pH環境促進了GP的釋放，因而本研究制備的納米粒子能夠實現GP的靶向傳遞和控制釋放，降低對正常細胞的毒副作用，提高抗前列腺癌效果。

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Preparation and Characteristics Study of the pH-Responsive Hyaluronic Acid-Gossypol Nanoparticles

SHIYu， WANG Lijuan， XU Shanshan， LIU Xiao， XU Feige，ZHANGManyue， ZHU Dongqi， CHEN Jingxiao， CHEN Jinghua*
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

A pH-responsive hyaluronic acid-gossypol conjugate was prepared based on boronate ester，which could be used as prostate cancer therapy.The conjugate could self-assemble into nanoparticle which morphology was observed by transm ission electron microscopy.The nanoparticleswere well-dispersed w ith 40 nm diameter.The pH responsible drug release behavior was confirmed by in vitro drug release study.In vitro cytotoxicity study illustrated a favorable selectivity，since the half maximal inhibitory concentration （IC50）of the nanopaticles against prostate cancer cells was lower than that of normal cells.The designed nanoparticle showed great potential for targeted delivery ofgossypoland treatmentofprostate cancer.

pH-responsive，boronateester，gossypol，nanoparticles，cytotoxicity

R 944.9

A

1673—1689（2017）04—0400—05

2015-05-12

江蘇省自然科學基金項目（BK2012557）；江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目（KYLX_1172）；江南大學大學生創新訓練計劃項目（2015315Y）；安徽大學現代生物制造協同創新中心開放課題（BM2015008）。

*通信作者：陳敬華（1971—），男，湖北黃石人，理學博士，教授，博士研究生導師，主要從事生物制藥及活性大分子研究。

E-mail：jhchenwhut@126.com

施瑜，王麗娟，徐珊珊，等.pH響應型透明質酸-棉酚納米粒子的制備及其性能研究[J].食品與生物技術學報，2017，36（04）：400-404.