豬傳染性胃腸炎核酸疫苗免疫小鼠后的血清抗體IgG檢測

劉霞

（四川省內江市種豬場，四川內江641007）

豬傳染性胃腸炎核酸疫苗免疫小鼠后的血清抗體IgG檢測

劉霞

（四川省內江市種豬場，四川內江641007）

本試驗旨在對豬傳染性胃腸炎核酸疫苗（含有TGEV-S基因質粒）開展免疫原性研究，為科學評價該TGE核酸疫苗的免疫效果提供依據。通過灌胃口服免疫TGE核酸疫苗誘導小鼠機體產生特異性免疫，定期采樣監測其血清抗體產生規律，采用間接ELISA方法測定免疫小鼠血清抗體IgG的抗體效價。結果發現：TGE核酸疫苗免疫小鼠后有效地激發了TGEV特異性抗體，首免后第二周開始就能檢測到血清抗體應答，且該組抗體水平一直都與空載體組和PBS空白對照組之間呈極顯著差異（P＜0.01），表現出良好的免疫原性。

豬傳染性胃腸炎；核酸疫苗；血清抗體IgG；間接ELISA

豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的一種以仔豬嘔吐、腹瀉和高致死率為主要特征的急性、高度接觸性傳染病[1-2]，是造成仔豬早期死亡的重要疫病之一[3-4]。TGE被世界動物衛生組織（OIE）確定為B類傳染病，是我國法定檢疫的疫病。TGEV屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，是單股正鏈RNA病毒，主要編碼4種結構蛋白：核蛋白（N），膜蛋白（M），纖突糖蛋白（S），小膜蛋白（sM）[5-6]。其中S蛋白對TGEV是非常重要的，是唯一能誘導機體產生中和抗體的結構蛋白，是基因工程研究的重點[7-8]。

目前研究表明，常規藥物對TGE的治療效果很不理想，疫苗接種是預防該病的有效方法[9-10]。針對TGEV腸道感染的特點，口服疫苗免疫是預防該病較為理想的途徑[5]。近年來，在TGEV口服疫苗方面的研究表明，以減毒沙門氏菌為載體攜帶DNA疫苗進行口服免疫，被證實具有運送效率高，方法簡單，免疫效果較好，安全性高，能同時激發全身免疫和局部黏膜免疫等優點，有著良好的應用前景。

正是基于TGEV的S蛋白在決定宿主的親嗜性、致病性、血凝性方面起關鍵作用并且是唯一能誘導機體產生中和抗體和提供免疫保護的結構蛋白，同時針對TGEV腸道感染和減毒沙門氏菌的特點，本試驗選用了以減毒沙門氏菌為載體的含TGEV S基因的核酸疫苗，結合病原TGEV的感染途徑和發病機理，通過灌胃免疫昆明小鼠，采集血清，通過間接ELISA法檢測小鼠血清抗體IgG的產生規律，以驗證該核酸疫苗的免疫效果，為科學評價該TGE核酸疫苗提供科學依據，也為以后在豬場投入使用該疫苗提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源TGE核酸疫苗（含S基因的重組減毒沙門氏菌），空載體（不含S基因的重組減毒沙門氏菌），由本單位實驗室保存。

1.1.2 主要試劑HRP標記羊抗鼠IgG酶標二抗，購自北京博奧森生物有限公司；TMB底物反應液，購自北京天根生物有限公司；卡那霉素（Kan），購自美國AMERSCO公司；BSA等。

1.1.3 自配試劑PBS溶液：稱取NaCl 8 g/L、KCl 0.2 g/L、KH2PO40.2 g/L、Na2HPO412.03 g/L，然后用1mol/L NaOH調節pH值至7.2，115℃高壓下滅菌20min，室溫下保存。

PBST洗滌液：在PBS溶液中加入0.1%吐溫-20即得。

包被緩沖液：稱取Na2CO31.59g和NaHCO32.93g，定容至1000mL后置室溫下保存備用。

反應終止液（2mol/L H2SO4）：向60mL雙蒸水中緩慢加入10.8mL濃硫酸，注意邊滴加邊攪拌，定容至100mL后置室溫下保存備用。

1.1.4 實驗動物6周齡雌性昆明小鼠，購自成都某生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 免疫小鼠分組將體重為20g左右的6周齡雌性昆明小鼠隨機分成3組（見表1），分別為TGE核酸疫苗組、空載體組、PBS對照組，每組16只小鼠。以每只小鼠1×109CFU/0.2mL灌胃免疫，免疫前禁食禁水4 h（使沙門氏菌得到充分免疫），免疫后1 h恢復正常飲食。一共免疫3次，每次間隔2周[11]。

表1 免疫小鼠分組

1.2.2 血清樣品制備各免疫組分別在免疫前和首免后的2、4、6周隨機捕殺4只昆明小鼠，摘眼采血[11]，血液置4℃下過夜以充分析出血清，然后4000 r/min離心5min收集血清，-20℃保存備用。

1.2.3 TGEV特異性血清抗體IgG的檢測取免疫前和首免后2、4、6周所采集的血清進行間接ELISA檢測，檢測時注意盡量減少血清的反復凍融，檢測的具體操作步驟如下：

（1）TGEV抗原包被：將表達純化的TGEV Sbc蛋白和包被緩沖液按終濃度10μg/100μL混勻，然后按100μL/孔加入到96孔酶標板，4℃下包被過夜。

（2）BSA封閉：甩干包被緩沖液，按250μL/孔加入PBST洗滌液，然后置于振蕩器上振蕩3min，叩干。如此重復3次。再按100μL/孔加入封閉液（BSA），置于37℃恒溫培養箱中封閉1h。

（3）加入待檢血清：甩干封閉液，按250μL/孔加入PBST洗滌液，然后置于振蕩器上振蕩3min，叩干。如此重復3次。按100μL/孔加入50倍稀釋的待檢血清，置于37℃恒溫培養箱中1h。

（4）加入HRP標記的羊抗鼠酶標二抗：取出后按250μL/孔加入PBST洗滌液，然后置于振蕩器上振蕩3min，叩干。如此重復3次。按100μL/孔加入5000倍稀釋的酶標二抗，然后置于37℃恒溫培養箱中1h。

（5）加入底物反應液：取出后按250μL/孔加入PBST洗滌液，置于振蕩器上振蕩3min，叩干。如此重復3次。按100μL/孔加入底物反應液（TMB），置于37℃恒溫培養箱中避光顯色15min。

（6）加入終止反應液：取出后按100μL/孔加入終止反應液以終止反應。

（7）讀數：終止反應后，使用ELISA酶標儀于波長450nm下測定OD450值。

1.2.4 數據處理應用SPSS17.0軟件對所測得的OD450值進行差異顯著性檢驗，數據用平均數±標準差（X±SEM）表示。

表2 免疫小鼠抗TGEV血清IgG抗體的間接ELISA檢測結果

圖1 免疫小鼠抗TGEV血清IgG抗體的間接ELISA檢測

2 結果與分析

免疫小鼠血清特異性IgG抗體檢測結果見表2、圖1。由表2可得，免疫前各組血清特異性IgG抗體水平都較低，組間差異不顯著（P＞0.05）；免疫后第2周，TGEV核酸疫苗組（含S基因）的抗體OD450值分別比空載體組和PBS對照組高0.081和0.097，且TGEV核酸疫苗組（含S基因）與空載體組、PBS組之間差異達到極顯著水平（P＜0.01），但空載體組和PBS組之間差異不顯著（P＞0.05），說明TGEV核酸疫苗組（含S基因）在小鼠體內成功地釋放了所攜帶的TGEV S基因，激發小鼠機體產生特異性TEGV IgG血清抗體；免疫后第4周和第6周，TGEV核酸疫苗組（含S基因）的血清特異性IgG抗體水平與空載體組、PBS組的差異進一步擴大，均達到極顯著水平（P＜0.01），且空載體組和PBS組之間差異也極顯著（P＜0.01）。

圖1顯示，在整個試驗過程中，隨著免疫次數的增加，TGEV核酸疫苗組（含S基因）的血清特異性抗體IgG水平持續上升，其中0～4周上升幅度較大，4～6周上升幅度較小；空載體組的血清抗體IgG水平在0～4周也有較大提高，但增幅明顯較TGE核酸疫苗組（含S基因）低，且三免后兩周略有下降；PBS組的血清特異性抗體IgG水平有升有降，但始終維持在較低的水平。

3 分析

核酸疫苗是20世紀90年代誕生的基因工程重組疫苗，因其制備工藝簡單，能有效激發全面的免疫應答，便于制備多價與多聯疫苗，使用安全而被廣泛應用于多種疫病的疫苗研究中，并取得了良好的試驗效果。豬傳染性胃腸炎（TGE）是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒引起的一種消化道傳染病，其中2周齡以內的仔豬死亡率高達100%[12-14]。該病在我國許多地方豬場均有發生，近年來有擴大流行的趨勢，也是世界各國引起仔豬早期死亡的重要疫病之一。目前的研究表明藥物對TGE的治療效果不明顯，對該病只能采取“疫苗預防為主，藥物治療為輔”的方針。因此，TGE核酸疫苗的研究與開發一直是近年來該病的研究重點。隨著對病原的深入研究，發現TGEV的S蛋白含有宿主細胞氨肽酶（pAPN）的識別位點，在病毒感染、發揮致病性和決定宿主細胞親嗜性等方面起關鍵作用，而且S蛋白攜帶的B淋巴細胞抗原決定簇，是唯一能誘導機體產生中和抗體與提供免疫保護作用的結構蛋白。因此S蛋白是TGE疫苗研究的重點。

本試驗選擇了以減毒沙門氏菌作為載體的含TGEV-S基因的核酸疫苗，灌胃免疫昆明小鼠，在首免后第2周就能檢測到特異性血清抗體應答，且該組抗體IgG水平一直都與空載體組和PBS空白對照組之間呈極顯著差異（P＜0.01），表現出良好的免疫原性，有效地激發了TGEV特異性血清抗體。

4 結論

本試驗采用灌胃免疫昆明小鼠并定期采集血清，通過間接ELISA方法摸清了血清特異性IgG抗體產生的規律。結果表明：TGE核酸疫苗成功地激發了小鼠機體內的體液免疫應答，產生了TGEV特異性抗體，表現出了良好的免疫原性，一定程度上說明該TGE核酸疫苗效果良好，可適當在豬場投入使用。

[1]楊恒，曹三杰，黃小波，等.TGEV雙基因嵌合表達質粒pVAX-S-N的構建及體外表達[J].中國獸醫學報，2009，29（3）：254-257.

[2]曹軍平，朱愛萍，肖作煥，等.豬傳染性胃腸炎的診斷與防制[J].中國動物檢疫，2000（6）：29.

[3]冉智光，王玉春.豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學研究新進展[J].天津畜牧獸醫，1998，15（4）：4-6.

[4]斯特勞B E.豬病學[M].趙德明，張中秋，沈建忠，譯.北京：中國農業大學出版社，2000.

[5]Krempl C，Schultze B，Laude H，et al.Point mutations in the S protein connect the sialic acid binding activity with the enteropathogenicity of transmissible gastroenteritis coronavirus[J].J Virol，1997，71（4）：3285-3287.

[6]Jimenez G，Correa L，Melgosa M P，et al.Critical epitopes in transmissible gastroenteritis virus neutralization[J].J Virol，1986，60（1）：131-139.

[7]姜騫.豬傳染性胃腸炎檢測試劑的研制及快速診斷方法的研究[D].哈爾濱：東北農業大學碩士學位論文，2003.

[8]楊樂樂.豬傳染性胃腸炎病毒S基因表達的研究及其原核表達產物的生物學活性分析[D].武漢：華中農業大學碩士學位論文，2005.

[9]任玲，李廣興，張宏偉.豬傳染性胃腸炎病毒S基因核酸疫苗免疫小鼠體液免疫功能變化的研究[J].畜牧獸醫雜志，2007，26（5）：16-18.

[10]胡延春，鄭傳廷，王妍，等.現代科技對動物疫病防控的推動作用[J].中國畜牧獸醫文摘，2009（6）：38-40.

[11]師東方，李一經，唐麗杰，等.豬傳染性胃腸炎病毒核酸免疫昆明鼠的抗體應答[J].中國獸醫科技，2003，33（8）：31-34.

[12]Enjuanes L，Sune C，Gebauer F，et al.Antigen selection and presentation to protect against trans missible gastroenteritis coronavirus[J].Veterinary Micro Biology，1992，33（1-4）：249-262.

[13]Hooper B E，Haelterman E O.Concepts of the pathogenesis and passive immunity in transmissible gastroenteritis of swine[J].J Am Vet Med Assoc，1966，149：1580-1586.

[14]王樹成，趙祥平.豬傳染性胃腸炎病毒在組織細胞上增殖的研究[J].中國畜禽傳染病，1998，20（1）：21-22.

Detection of the Serum IgG Antibody in M ice A fter Being Immunized w ith TGE Nucleic Acid Vaccine

Liu Xia
（Pig Breeding Farm of Neijiang City，Sichuan Neijiang 641007，China）

In order to provide theoretical basis for scientific evaluation，this experiment was conducted to study the immunogenicity of the TGE nucleic acid vaccine，carring S gene of TGEV.To induce specific immunity，the female Kunming mice were orally immunized with the TGE nucleic acid vaccine.The samples of serum were collected every two weeks within 1～6 weeks after being immunized and detected for specific IgG antibody titer by the indirect ELISA.The results showed that TGE nucleic acid vaccine could induce high titer antibody，the specific IgG antibody was induced starting from the second week after the first immunization，the IgG antibody of TGE nucleic acid vaccine，carring S gene of TGEV in the experimental group was higher than that of the latter two control groups and distinguished significantly（P＜0.01），and showed good immunogenicity.

TGE；Nucleic acid vaccine；Serum IgG antibody；Indirect ELISA

S852.43

B

1001-8964（2017）05-0027-04

2017-03-01

劉霞（1986-），女,四川隆昌人，農學學士，助理獸醫師，主要從事內江豬保種相關工作。