淫羊藿總黃酮對大鼠心肌急性缺血再灌注損傷氧化應激干預機制的研究

張衛萍+鄧楊陽+任建勛+李晶瑾+陳濤+郜姍姍

[摘要]觀察淫羊藿總黃酮對大鼠心肌急性缺血再灌注損傷氧化應激干預作用及其機制。40只雄性大鼠隨機分為假手術組，模型組，地爾硫卓組（陽性對照藥）以及淫羊藿總黃酮高、低劑量組，每組8只。淫羊藿總黃酮分別以200，100mg·kg^-1的劑量連續灌胃給藥4d后，結扎冠狀動脈前降支40min再灌注4h建立大鼠急性心肌缺血再灌注損傷模型。采用N-BT染色法測定心肌梗死范圍，比色法檢測心肌組織中SOD和T-AOc活性及MDA含量，ELISA法測定血清TnI水平，同時光鏡下觀察心肌組織結構的變化，分別應用免疫組化和westem blot法觀察心肌組織中SIRT1與Nrf2表達的變化。結果發現，與模型組比較，淫羊藿總黃酮高、低劑量組以及地爾硫卓組能明顯減少心肌梗死范圍，降低血清TnI水平，提高心肌組織中SOD和T-AOC活性并降低MDA含量（P<0.05或P<0.01），改善缺血再灌注損傷后心肌的組織結構，同時淫羊藿總黃酮高、低劑量組中心肌組織SIRT1和Nrf2表達明顯增加（P<0.05或P<0.01）。由此可見，淫羊藿總黃酮能夠通過提高機體SIRT1與Nrf2內源性抗氧化信號傳導通路，增加心肌組織的抗過氧化能力，從而抑制心肌急性缺血再灌注過程中氧化應激反應導致的心肌細胞不可逆性傷害，維護心肌組織的正常功能。

[關鍵詞]淫羊藿總黃酮；氧化應激；缺血再灌注損傷；干預機制

氧化應激（oxidative stress）反應是機體在各種損傷因素的刺激下，體內的活性分子包括活性氧自由基產生過多，超出機體對過氧化物的清除能力，破壞氧化與抗氧系統之間的平衡，從而造成機體組織的氧化損傷。心肌缺血再灌注是引起冠心病心肌損傷的重要病理機制，多見于冠心病溶栓、PCI治療等過程中。而由心肌缺血再灌注過程中產生的大量的活性氧族（ROS）已被證實是再灌注損傷的重要機制。因此對心肌缺血再灌注損傷過程中氧化應激的干預是減輕心肌壞死或凋亡、保護心臟功能、改善預后的主要途徑和藥理作用靶點。淫羊藿總黃酮是中藥淫羊藿的主要有效部位，對免疫、內分泌、心腦血管系統以及骨和腫瘤組織等具有多方面藥理活性。盡管研究證實淫羊藿有效成分作為天然的抗氧化劑，能夠明顯改善大鼠心肌缺血再灌注后損傷，但是對其抗氧化作用的機制尚未深入研究。本研究旨在探討淫羊藿總黃酮通過其抗氧化應激作用發揮對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護的機制。

1材料

1.1動物

健康雄性SD大鼠40只，SPF級，體重200～220g，斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司提供，合格證號SCXK（京）2011-0004。適應性喂養3d后開始實驗。

1.2藥物與試劑

淫羊藿總黃酮購自陜西惠科植物開發有限公司；鹽酸地爾硫卓片（合心爽，50mg/片，批號1107050）購白天津田邊制藥有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號20150810），丙二醛（MDA）試劑盒（批號20150810），總氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒（批號20150508）購自南京建成生物工程研究所；大鼠肌鈣蛋白（TnI）ELISIA測定試劑盒購自美國ANDYGENE公司；抗SIRT1小鼠單克隆抗體（abl04833），抗核因子相關因子2（Nrf2）大鼠單克隆抗體（ab89443）購自英國abeam公司；BCA蛋白測定試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；超敏ECL化學發光試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

1.3儀器

DENLEY DRAGON Wellsean MK 3酶標儀（美國Thermo公司）；Biofuge traetos低溫高速離心機（德國Heraeus公司）；蛋白垂直電泳系統（美國bio-rad公司）；LEICA HM335E病理切片機LEICA[（德國）公司]；Nikon 501光學顯微鏡[Nikon（日本）公司]。

2方法

2.1分組與給藥

動物隨機分為5組，每組8只，分別為假手術組（給予等體積生理鹽水，5 mL·kg^-1），模型組（給予等體積生理鹽水，5 mL·kg^-1），西藥對照藥地爾硫卓組（10 mg·kg^-1），淫羊藿總黃酮高劑量組（200mg·kg^-1），淫羊藿總黃酮低劑量組（100mg·kg^-1）。以上各組采用的干預藥物均以生理鹽水配至所需濃度，給藥體積為5 mL·kg^-1，連續灌胃給藥4d后，采用冠狀動脈結扎法誘導大鼠心肌缺血再灌注模型。

2.2大鼠心肌缺血再灌注模型的建立

參考文獻方法，大鼠以戊巴比妥鈉腹腔麻醉（45 mg·kg^-1）后，仰位插入氣管插管，接動物呼吸機行人工呼吸；開胸后暴露心臟，撕開心包膜，在肺動脈圓錐和左心耳之間，于冠狀動脈左前降支根部，即穿線（0號縫合線）待結扎用。待大鼠穩定10min后行冠狀動脈左前降支結扎。結扎后心肌缺血的可靠性通過同步監測心電圖Ⅱ肢體導聯，表現為J點或ST段的抬高和T波改變，以及心臟表面由紅潤變為蒼白。假手術組大鼠僅進行冠狀動脈左前降支根部穿線，但不結扎。在冠狀動脈左前降支結扎40min后剪斷結扎線，實現再灌注過程，縫合胸壁，動物恢復自主呼吸。隨后再灌注240min后結束試驗。

2.3指標檢測

2.3.1大鼠心肌梗死范圍及測定心肌再灌注末，于心臟結扎線以下水平橫切5片，進行N-BT染色，掃描后采用Image-pro plus圖像分析系統，測量總心肌面積及梗死心肌面積。

2.3.2心肌組織中SOD和T-AOC活性及MDA含量的測定心肌再灌注末，于心臟結扎線下遠心端1/3處取心肌組織，進行組織勻漿，4 000 r·min^-1離心15min，取上清液，采用比色法測定心肌組織中MDA含量以及SOD和T-AOC活力，具體操作按試劑盒說明書進行。

2.3.3血清肌鈣蛋白I（troponin I，TnI）的測定心肌再灌注末，經大鼠腹主動脈抽取全血3 mL，常溫3000 r·min^-1離心15min，取上清，采用ELISA法測定血清TnI水平，具體操作按試劑盒說明書進行。

2.3.4心肌組織病理學觀察實驗結束后，于心臟結扎線下近心端取心肌組織，10%甲醛固定，石蠟包埋后切片，蘇木素.伊紅（HE）染色，光鏡下觀察病理變化。

2.3.5心肌缺血遠端組織SIRTl蛋白表達檢測心肌再灌注結束后，于心臟結扎線下遠心端1/3處取心肌組織，10%甲醛固定，石蠟包埋后切片、脫蠟。采用H₂O₂去除內源性過氧化物，將切片放入0.01mol·L^-1枸櫞酸緩沖液中進行微波修復。5%牛血清白蛋白（BSA）封閉20 min，加入抗SIRT1小鼠單克隆抗體（1：500）37℃孵育30 min。PBS充分漂洗后，依次滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG進行結合反應，DAB顯色后蘇木素復染，鹽酸分化，脫水封片，進行鏡下觀察。利用IPP6.0圖像分析系統進行圖像分析，隨機選擇5個視野對陽性細胞進行平均灰度值測定。

2.3.6心肌缺血遠端組織Nrf2蛋白表達檢測心肌再灌注結束后，于心臟結扎線下遠心端1/3處取心肌組織進行勻漿，采用BCA法測定總蛋白濃度后進行SDS-PAGE電泳，蛋白質以12%凝膠分離后轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，大鼠Nrf2單克隆一抗（1：1000）4℃孵育過夜，PBS沖洗后加入二抗室溫下孵育3h，ECL化學發光法顯影、轉片、掃描；利用Photoshop軟件分析蛋白印跡條帶的灰度值。以目的蛋白與-actin光密度值的比值作為該目的蛋白的相對表達量。

2.4統計學方法

實驗結果以X±S表示，采用One-Way ANOVA（單因素方差分析）方法，方差齊性應用LSD檢驗，方差不齊采用Tamhane's T2檢驗。P<0.05為有統計學意義。

3結果

3.1心肌缺血再灌注損傷程度的變化

與模型組比較，地爾硫卓組大鼠心肌梗死面積以及梗死區占心室面積百分比明顯下降，具有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，地爾硫卓組，淫羊藿總黃酮高、低劑量組大鼠心肌梗死面積以及梗死區占心室面積百分比也同樣明顯下降，具有統計學意義（P<0.05或P<0.01），見表1。

3.2血清TnI含量的變化

與假手術組比較，模型組大鼠血清TnI含量明顯升高，具有明顯的統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，地爾硫卓組，淫羊藿總黃酮高、低劑量組大鼠血清TnI含量明顯減低，具有統計學意義（P<0.05或P<0.01），見表2。

3.3心肌組織中SOD和T-AOC活性及MDA含量的變化

與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織MDA含量明顯升高，SOD與T-AOC活力明顯下降，具有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，地爾硫卓組大鼠心肌組織MDA含量明顯下降，同時SOD與T-AOC活力明顯提高，具有統計學意義（P<0.01）；同時淫羊藿總黃酮高、低劑量組大鼠心肌組織MDA含量也明顯下降，SOD與T-AOC活力則有一定程度的升高，見表3。

3.4心肌組織病理學改變

假手術組大鼠心肌纖維排列整齊，結構清楚，肌束排列有序，心肌細胞無水腫；模型組動物心肌細胞水樣變性明顯，排列紊亂，肌束間隔增寬，間質多量炎細胞浸潤。地爾硫卓組心肌細胞肥大，水樣變性略減輕，輕度排列紊亂，肌束間隔略增寬，間質內可見部分炎細胞浸潤。淫羊藿總黃酮組心肌細胞可見輕中度水樣變性，排列無序，肌束間隔略增寬，間質有一定量的炎細胞浸潤，淫羊藿總黃酮2個劑量組心肌組織病理學變化無明顯的差異性改變，見圖1。

3.5心肌缺血遠端組織SIRT1蛋白表達的變化

與假手術組比較，模型組以及大鼠缺血遠端心肌組織SIRT1蛋白表達具有一定程度的提高（P<0.05）；與模型組比較，淫羊藿總黃酮高、低劑量組梗死區遠端心肌組織SIRT1蛋白表達明顯提高，具有統計學意義（P<0.05），見表4，圖2。

3.6心肌缺血遠端組織Nrf2蛋白表達的變化

與假手術組比較，模型組Nrf2蛋白表達明顯降低；與模型組比較，淫羊藿總黃酮高、低劑量組Nrf2表達均顯著增強（P<0.05或P<0.01），見圖3，表5。

4討論

心肌缺血再灌注損傷時，通過黃嘌呤氧化酶系統、激活的中性粒細胞、線粒體呼吸鏈功能異常產生大量氧自由基。大量活性氧導致的氧化應激是心肌細胞死亡、收縮與舒張功能下降的重要起始因素。在本研究中采用冠狀動脈左前降支結扎法誘導心肌急性缺血再灌注的病理過程，使心肌組織處于急性缺氧/復氧狀態下，由此心肌細胞線粒體電子轉移障礙而產生大量的自由基。自由基蓄積過多，引起脂質、蛋白質和核酸的過氧化，使膜結構遭到破壞、蛋白降解、核酸主鏈斷裂，最終細胞崩解，造成心肌的不可逆性損害，表現為心肌中MDA含量增加以及SOD與T-AOC活力下降；同時心肌出現大片的梗死區，心肌細胞和組織的結構呈現明顯的損傷改變，與心肌損傷相關的血清標志酶TnI水平升高，其與心肌的損傷程度呈正比。因此針對心肌缺血再灌注損傷過程中氧化應激的處理措施可明顯減少心肌梗死范圍，保護心功能。

目前研究發現心臟組織還存在內源性抑制氧化應激反應的途徑，以減少應激狀態下自由基對細胞的損傷，從而改善心臟功能，成為干預氧化損傷研究的新靶點。Nrf2與Sirtl是近年來被證實的與抗氧化應激相關的轉錄因子，分別通過不同的通路，在調控機體氧化應激方面發揮著重要的作用。Sirtl是依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，在心臟和腦組織中分布較多，多表達在細胞核中。研究顯示，細胞核中的Sirtl可能增加對心肌細胞保護功能。在氧化應激初期過程中心肌細胞中Sirtl的過表達通過Sirtl-FoxO1依賴途徑或增加FoxO3和FoxO4活性以保護心肌細胞免于氧化應激損傷。中藥成分白藜蘆醇能通過增加細胞核中Sirtl誘導Mn-SOD生成，保護心臟減少氧化應激損傷。同樣，在心肌細胞穩定表達的Nrf2也具有抗心肌細胞氧化損傷的作用。Nrf2在外來刺激作用下與其阻遏蛋白Keapl解離，再通過與抗氧化反應元件（anti-oxidant response element，ARE）結合，形成Nrt2/ARE通路，啟動下游多種抗氧化蛋白類基因的表達，達到保護細胞免疫與氧化應激損傷的目的。本研究顯示在心肌缺血再灌注誘導的過氧化反應過程中，與抗自由基氧化相關的Nrf2表達下降，提示心肌細胞的抗氧化能力下降，導致自由基代謝失衡，引起心肌損傷。但是結果也顯示，模型組大鼠心肌SIRT1表達明顯增加，說明缺血后心肌遠端組織低灌注狀態下的細胞呼吸鏈功能失常產生的過氧化物質刺激組織抗氧化應激效應出現代償性增加，但是這種應激性的抗氧化保護作用具有一定的時效性，往往隨缺血時間的延長和程度的加重逐漸減弱。

已有證實，淫羊藿及其活性成分可以明顯保護大鼠心肌缺血再灌注損傷，與其抗炎和抗自由基反應相關。本研究同樣顯示，淫羊藿總黃酮對大鼠急性缺血再灌注引起的心肌損傷具有一定程度的保護作用，可以明顯降低血清心肌酶損傷標志物TnI，減少心肌梗死的范圍，減輕心肌組織形態結構的損傷。同時提高心肌組織中SOD與T-AOC抗氧化活力，相對應的減少MDA含量。進一步研究發現，淫羊藿總黃酮干預后心肌組織細胞中抗氧化因子Nrf2和Sirt1表達也明顯升高，通過核轉錄促進組織的抗氧化效應，抑制心肌的氧化性損傷。此外本研究還提示，心肌缺血再灌注導致的脂質過氧化反應在一定程度激活了Sirt1相關的信號通路，從而促使下游的SOD等抗氧化物質的生成，部分提高了機體總抗氧化能力，發揮其在組織氧化損傷的病理條件下對心肌組織的適應性保護作用。而淫羊藿總黃酮則進一步通過促進心肌組織Nrf2和Sirt1的表達，提高機體的抗氧化能力，抑制過氧化物質的心肌細胞損傷效應，防止再灌注過程中心肌壞死的進一步發展。