酸堿預處理后酶解提升丹參藥渣中丹參酮類成分的提取效率研究

戴新新+沈飛+宿樹蘭+張森+郭盛+江曙+錢大瑋+段金廒

[摘要]通過酸堿預處理丹參藥渣，并利用纖維素酶降解，比較不同處理方法對丹參酮類成分提取效率的影響，以期為丹參藥渣中丹參酮類成分的開發利用提供科學依據。結果表明，未經酸堿預處理的丹參藥渣中，當酶c濃度為6U·mL^-1，酶解4.5d時可使大部分纖維素降解，所得葡萄糖質量分數最高為59.74mg·g^-1。對不同預處理方法評價，發現堿預處理.纖維素酶c降解后的效果最佳，葡萄糖質量分數達119.50 mg·g^-1，相同濃度纖維素酶c酶解的酸預處理藥渣次之。丹參酮的提取量經酶液降解后，與常規非酶法處理相比，丹參酮Ⅱ_A提取量提高了82.54%，質量分數達2.451 mg·g^-1；丹參酮Ⅰ提取量提高了81.82%，質量分數達2.373mg·g^-1；隱丹參酮提取量提高了64.4%，質量分數達1.080mg·g^-1；二氫丹參酮Ⅰ提取量提高了61.3%，質量分數達0.6012mg·g^-1。通過酸堿預處理與纖維素酶降解相結合的方法可有效提高丹參藥渣中丹參酮類成分的提取效率，該方法具有可操作性和實用性，有利于提升丹參藥渣中丹參酮類資源性化學物質的利用效率。

[關鍵詞]丹參藥渣；丹參酮；酸堿預處理；酶解

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltior-rhiza Bge的干燥根和根莖，主產于山東、河北、安徽、河南等地，始載于《神農本草經》，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰功效。用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風、冠心病、心絞痛、心肌梗塞等癥的治療。丹參酮（tanshinone）是丹參中脂溶性松香烷型二萜類化合物，具有廣泛的藥理作用和臨床應用價值，受到醫藥學家的高度關注。目前，丹參類注射液制備生產過程主要采用水提醇沉工藝，致使脂溶性的丹參酮類成分殘留于藥渣中，未得到充分利用導致丹參資源性化學物質的浪費和資源利用效率低，同時造成環境污染。

此外，丹參藥渣中富含纖維素類、半纖維素類以及木質素類成分，如能將纖維類物質轉化降解成為糖類物質，既可提升丹參藥渣中丹參酮類成分的提取效率，又可將其進行生物轉化開發動物飼料、肥料等，對于實現丹參資源的多途徑、多層次綜合利用具有重大的現實意義和應用價值。細胞壁是阻礙代謝產物溶出的主要因素，因此，采用纖維素酶對細胞壁進行降解，可在平衡生產成本和提取效果的基礎上，確定一套溫和、環保、節能的丹參酮提取工藝。

本文在前期研究基礎上，采用纖維素酶降解的方法對丹紅注射液生產過程中產生的丹參藥渣進行預處理后，提取丹參酮類成分，以期提升丹參酮類成分的提取效率，從而為丹參藥渣的資源化利用提供科學依據。

1材料

美國Waters 2695高效液相色譜系統，Waters2998 PDA檢測器，Waters 2424型ELSD檢測器（Waters公司），Empower數據管理系統，FW80型高速萬能粉碎機（天津），DHG-9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海），TDL-80-2B型離心機（上海），KH-500型超聲波清洗儀器（昆山），ML204/02、MS-205電子天平（上海），IS-RDV1型恒溫振蕩器（美國精騏），Perkin Elmer酶標儀（Enspire公司）。

甲醇、甲酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸、乙酸鈉、氫氧化鈉、3，5.二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉、苯酚、羥甲基纖維素鈉、硫酸均為分析純，乙腈（美國TEDIA公司）為色譜純試劑。葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院）、二氫丹參酮I（南京春秋生物工程有限公司，批號20140516）、丹參酮I（中國食品藥品檢定研究院，批號110867-200406）、隱丹參酮（中國食品藥品檢定研究院，批號110852300806）、丹參酮Ⅱ_A（中國食品藥品檢定研究院，批號110766-200619），纖維素酶分別為自制酶液（纖維素酶A）和國產纖維素酶（纖維素酶B）以及購自SIG-MA公司的纖維素酶（纖維素酶C）。水為實驗室自制超純水。丹參藥材與丹參固體廢棄物在2016年3月收集于菏澤步長制藥有限公司，經南京中醫藥大學段金廒教授鑒定為丹紅注射液生產過程中產生的丹參固體廢棄物。

2方法

2.1纖維素酶活力的測定

2.1.1試劑的配制3，5-二硝基水楊酸（DNS）顯色劑的配制：10g氫氧化鈉，10g3，5.二硝基水楊酸，200g酒石酸鉀鈉，0.5g亞硫酸鈉，2g苯酚，純水定容至1000mL，避光保存，1周后可用。

試劑配制：0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液（CMC），0.1mol·L^-1pH4.5的乙酸.乙酸鈉緩沖液，1.05 g·L^-1的葡萄糖溶液，0.1mol·L^-1pH4.8的檸檬酸.檸檬酸鈉緩沖液。

酶液的配制：分別準確稱取纖維素酶A，B，C各2g，精確至0.0001g，加入50mL的檸檬酸鹽緩沖液，從中取出1mL再定容至100mL，（以保證稀釋后的纖維素酶活力應在0.04～0.08 U·mL^-1）待測。

2.1.2酶活力葡萄糖標準曲線的繪制

分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的葡萄糖于6支試管中，用超純水稀釋至1mL，加DNS顯色劑3mL，搖勻后沸水浴中煮沸10Min，冷卻，定容至10mL，充分混勻。在520nm波長下各管溶液的吸光度并記錄結果。以葡萄糖質量濃度（g·L^-1）為橫坐標，以對應的吸光度為縱坐標，繪制出葡萄糖標準曲線。

2.1.3纖維素酶活力測定

取2.1.1項下酶液各1mL，分別加入0.5%CMC 3mL，在50℃水浴中酶解30min，沸水浴10min使酶失活，得到酶解液，冷卻后加入3mL顯色液，沸水浴10min，冷卻加水定容至10mL，在550nm處測定吸光度。纖維素酶單位的定義：在50℃，pH 7.0的條件下，每30min分解羧甲基纖維素鈉釋放1mg葡萄糖所需要的酶量為1個酶活力單位U。纖維素酶活力的計算公式見文獻。

2.1.4空白對照的測定

取1mL酶液，沸水浴5min，冷卻后加入0.5%CMC 3mL，與樣品同時放入50℃水浴30min。其他操作同2.1.3項下進行。

2.2酶解纖維素產生葡萄糖的測定方法

2.2.1丹參藥渣預處理將水提取后的丹參藥渣在60℃溫度下烘干，取干燥藥渣打粉，過20目篩，備用。

2.2.2丹參藥渣酸、堿預處理方法

采用4%硫酸與丹參藥渣10：1（mL·g^-1）混合，攪拌均勻后，90℃水浴1.5 h；采用10%氫氧化鈉溶液與丹參藥渣6：1（mL·g^-1）混合，攪拌均勻后，90℃水浴1.5h。將酸、堿預處理后的丹參藥渣用蒸餾水洗滌至中性，然后在60℃下烘干，研磨至均勻的顆粒大小，備用。

2.2.3樣品的配制將纖維素酶溶解于檸檬酸.檸檬酸鈉緩沖液中，藥渣與乙酸.乙酸鈉緩沖溶液混合，根據相應條件加入不同量的酶液，置于50℃，180 r·min^-1的恒溫搖床內進行酶解，定時取樣測定。

2.2.4酶濃度的影響加入一定量的酶液，將反應體系中底物酶的濃度配制成1.25，2.5，3.75，5，7.25 U·mL^-1。反應一定時間后，取出加入3mLDNS，沸水浴5min，終止反應，然后放入冷水中，在8000 r·min^-1下離心10min，取上清液，過0.22μm的濾膜，測定葡萄糖的含量。

2.2.5酶解反應時間的影響加入一定量的酶液，反應時間分別為36，60，84，108，132，156 h取出加入3 mL DNS，沸水浴5min，終止反應，然后放入冷水中，在8 000 r·min^-1下離心10min，取上清液，過0.22μm的濾膜，測定葡萄糖的含量。

2.2.6葡萄糖測定的色譜條件檢測器：EISD，色譜柱：XBridge Amide（4.6mmx150mm，3.5μm），柱溫30℃，流速0.8mL·min^-1，進樣量10μL，以乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）80：20為流動相，等度洗脫，增益10，噴霧器加熱，動力60%，漂移管溫度80℃，氣體壓力40 psi（1 psi=6.89 kPa）。

2.3丹參酮類化學成分分析方法

2.3.1對照品溶液的制備分別精密稱取二氫月參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅱ_A對照品適量，用甲醇配成質量濃度分別為0.024 8，0.152，0.209，0.126 g·L^-1的對照品儲備液。

2.3.2樣品的配制取經過纖維素酶降解后的藥渣和未經過降解的藥渣，精密加入甲醇溶液30mL，精密稱定，浸泡16h后在30℃，100kHz下超聲30min，稱量補足失重，過濾，濾液在8000r·min^-1。下離心10min，取上清液，過0.22μm的濾膜，進樣。

2.3.3色譜條件色譜柱BDS HYPERSIL C₁₈（4.6mmX250 mm，5μm），柱溫30℃，流速1mL·min^-1，進樣量10μL，以乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）為流動相，梯度洗脫（0～8min，15%A；8～9min，15%～28%A；9～20min，28%A；20～22min，28%～54%A；22～28min，54%A；37～38min，54%～60%A；38～43min，60%～68%A；43～48min，68%～70%A；48～52min，70%～15%A），色譜圖見圖1。

2.3.4線性范圍的考察取適量二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮Ⅱ_A對照品，分別進樣1，2，5，10，20μL；按2.3.3色譜條件進樣記錄峰面積積分值。以峰面積積分值y為縱坐標，進樣濃度x為橫坐標，得二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮Ⅱ_A的回歸方程。

2.3.5重復性試驗按照上述方法制備6份樣品溶液，按上述色譜條件測定二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮Ⅱ。的RSD。

2.3.6 精密度試驗精密吸取對照品貯備液10ixL，連續進樣6次，測定二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮Ⅱ_A色譜峰峰面積，計算得RSD。

2.3.7穩定性試驗取同一批對照品溶液，每隔4h測定1次，測定6次，最終得到二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮Ⅱ_A的RSD。

2.3.8回收率試驗

精密稱定已知質量分數的樣品3份，加入適量對照品，混勻，按照2.3.3項方法處理，測定有效成分的含量，計算加樣回收率。

2.4樣品分析測定

精密吸取樣品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，計算樣品中二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮Ⅱ_A的含量。

3結果與分析

3.1纖維素酶活力的測定

3.1.1酶活力葡萄糖標準曲線的繪制

以光密度為縱坐標，葡萄糖質量濃度（g·L^-1）為橫坐標，得到葡萄糖標曲為Y=1.7224X-0.000 3，R²=0.9940，線性范圍210～1050μg。

3.1.2樣品酶活力測定通過檢測與計算，纖維素酶A的酶活力為1.03 U·mg^-1，纖維素酶B為1.35U·mL^-1，纖維素酶C的酶活力為50.02U·mL^-1。

3.2纖維素降解后葡萄糖含量測定

3.2.1葡萄糖標準曲線的繪制

以HPLC-ELSD方法檢測到的峰面積取對數后為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線，對應的回歸方程為Y=0.451 8X+5.910 9，R²=0.990 1。線性范圍1.05～21.00μg。此標準曲線線性關系良好，可用于葡萄糖的測定，色譜圖見圖2。

3.2.2酶的影響

通過不同酶濃度對丹參藥渣進行酶解處理，所用酶為纖維素酶C，當底物酶濃度升高時，葡萄糖的含量也隨著升高，酶在1.5～3U·mL^-1時降解得到葡萄糖為14.91～43.19 mg·g^-1。當酶為4.5 U·mL^-1時，葡萄糖的含量趨于平穩，當酶為6 U·mL^-1時，葡萄糖為59.74mg·g^-1，由此可知，最適宜酶底物為6 U·mL^-1，見圖3。

3.2.3酶解時間對纖維素降解率和葡萄糖濃度的影響纖維素酶C與底物的作用時間過長或過短都不能準確反映樣品的酶活力大小。酶解時間對纖維素降解的影響見圖4，酶濃度為6U·mL^-1，酶解1.5d可使大部分纖維素降解，所得葡萄糖質量分數為59.74mg·g^-1。酶解4.5～5.5 d時葡萄糖為74.60～79.60 mg·g^-1，且趨于穩定，因此，可選擇4.5d為最佳酶解反應時間。

3.2.4不同酶液處理對纖維素降解的影響將纖維素酶A，B，C分別加入到酸預處理和堿預處理的丹參藥渣中，降解后葡萄糖的含量見圖5，由圖5可知，堿預處理.纖維素酶C降解后的效果最佳，葡萄糖質量分數達119.50mg·g^-1，相同濃度纖維素酶C酶解的酸預處理藥渣次之。

3.3方法學考察結果

利用HPLC-PDA方法建立了二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮Ⅱ4個化合物含量測定的標準曲線，并進行了穩定性、重復性、及精密度等方法學考察。其所測定的結果見表1，所測化合物的方法學考察其RSD均小于2%，回收率在94.63%～102.1%，RSD小于2.3%。以上結果表明本實驗可以用于樣品中這4個丹參酮成分的檢測。

3.4不同預處理對丹參酮類成分的提取量的影響

與常規非酶法處理藥渣相比，丹參酮的提取量在通過酶液降解后，丹參酮Ⅱ。提取量提高可達82.54%，質量分數達2.451mg·g^-1；丹參酮I提取量提高可達81.82%，質量分數達2.373mg·g^-1；隱丹參酮提取量提高可達64.4%，質量分數達1.080mg·g^-1；二氫丹參酮I提取量提高可達61.3%，質量分數達0.601 2 mg·g^-1，見表2。通過比較不同處理方式總丹參酮提取效率可見，通過堿預處理.纖維素酶C降解后所得總丹參酮提取效率最高，酸預處理中纖維素酶C降解效果較佳，這與3.2.3項下纖維素酶降解纖維素的結果相一致。4討論

現代研究表明，丹參酮類成分具有抗氧化、心腦血管藥理作用、抗菌消炎作用以及肝保護等多種生物活性，尤其在抗腫瘤方面尤為突出，臨床上廣泛用于治療心腦血管疾病、感染性疾病以及糖尿病等的治療。由于丹參相關的制劑的使用量逐年增加，丹參酮和高純度丹參酮的需求量每年大幅增加。但技術力量較為薄弱，工藝較為陳舊，產品質量不穩定，生產成本高，經濟效益低，環境污染嚴重等諸多因素，造成丹參資源的極大浪費。

目前，丹參酮類的提取方法主要有非離子表面活性劑輔助提取、超臨界CO₂，萃取法、超順磁性吸附劑提取、超聲提取法、微波提取法、超高壓輔助提取等。上述提取方法均可不同程度的提高丹參酮的提取率，但酶解法可加速有效成分的釋放，還可將提取物中的雜質分解去除，也可促進某些極性低的脂溶成分轉化為易溶于水的糖苷類成分而利于提取，在中藥行業中的應用前景廣闊。

本實驗分析和比較了DNS法測定3種纖維素酶活力（自制酶液、國產纖維素酶以及SIGMA纖維素酶），結果顯示，SIGMA纖維素酶酶活力最佳；在前期研究的基礎上，對常規性的影響酶解反應因素，酶濃度和酶解反應時間等因素進行了單因素考察，確定了酶解的最適條件。并在此條件下，利用纖維素酶酶解丹參藥渣后提取丹參酮類成分，此方法操作簡便，適應性強。因此，提高丹參酮類成分的提取效率，可考慮將酶提取法與其他方法聯用，例如采用酸堿預處理后酶解或酶法提取后再用超聲提取，可大大提升丹參酮類成分的提取效率，獲得純度較高的提取物，且可減少提取過程中熱不穩定成分的損失。