西洋參藥材的質(zhì)量特征與商品規(guī)格的相關(guān)性分析

張丹+鄭開(kāi)顏+吳蘭芳+趙潤(rùn)懷+侯芳潔+王乾+由會(huì)玲+杜麗紅+黃璐琦+鄭玉光

[摘要]利用高效液相色譜法（HPLC）結(jié)合系統(tǒng)聚類(lèi)分析（HCA）和主成分分析（PCA）等現(xiàn)代化學(xué)計(jì)量法，分析了西洋參藥材傳統(tǒng)商品規(guī)格特征與7種人參皂苷類(lèi)成分（人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁，Rc，Rb₂，Rb₃，Rd）定量指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)，探索西洋參傳統(tǒng)商品規(guī)格特征與現(xiàn)代化學(xué)定量指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)性，為綜合評(píng)價(jià)西洋參藥材的質(zhì)量等級(jí)的制定提供理論基礎(chǔ)。采用HPLC指紋圖譜法對(duì)40批西洋參藥材進(jìn)行分析，共標(biāo)定19個(gè)峰，所有樣品的相似度均在0.900以上。在此基礎(chǔ)上，以加工方法、商品規(guī)格、7種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和作為原變量進(jìn)行聚類(lèi)分析及主成分分析，結(jié)果表明所收集的西洋參藥材質(zhì)量與產(chǎn)地信息相關(guān)性較大，而與傳統(tǒng)商品規(guī)格特征差別較小，說(shuō)明西洋參藥材傳統(tǒng)商品規(guī)格的劃分具有一定的局限性。研究結(jié)果揭示了西洋參藥材商品規(guī)格與傳統(tǒng)定性指標(biāo)、與化學(xué)成分定量指標(biāo)之間的內(nèi)在關(guān)系，對(duì)西洋參藥材質(zhì)量進(jìn)行客觀綜合定量評(píng)價(jià)提供了新思路。

[關(guān)鍵詞]西洋參；HPLC；指紋圖譜；商品規(guī)格；質(zhì)量評(píng)價(jià)

西洋參為五加科植物西洋參Panax quinquefoli-us L的干燥根。原產(chǎn)于美國(guó)威斯康辛州和加拿大蒙特利爾、魁北克省。在我國(guó)已有300多年應(yīng)用歷史，我國(guó)于20世紀(jì)70年代開(kāi)始引種，目前已形成吉林、遼寧和山東3個(gè)主產(chǎn)區(qū)。國(guó)產(chǎn)西洋參由參商收購(gòu)鮮參就地烘干運(yùn)回銷(xiāo)地后，進(jìn)行剪枝分等。按照行規(guī)，單支重<5g、病疤參均屬于等外參?，F(xiàn)行西洋參等級(jí)規(guī)格基本上按長(zhǎng)度指標(biāo)分成長(zhǎng)、中、短支。參商在分等時(shí)兼顧長(zhǎng)度和直徑，靈活掌握等級(jí)劃分。筆者通過(guò)市場(chǎng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前西洋參藥材商品規(guī)格的劃分主要是依據(jù)市場(chǎng)銷(xiāo)售情況、消費(fèi)者的購(gòu)買(mǎi)習(xí)慣及西洋參加工后的形態(tài)特征，根據(jù)長(zhǎng)度結(jié)合單支質(zhì)量，兼顧產(chǎn)地等進(jìn)行劃分，見(jiàn)表1，與周海燕等調(diào)查結(jié)果相一致。

近年來(lái)，針對(duì)西洋參化學(xué)成分、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等方面的研究報(bào)道較多，但很少對(duì)其不同商品規(guī)格間質(zhì)量差異進(jìn)行研究。為了進(jìn)一步研究并揭示不同商品規(guī)格的西洋參藥材的品質(zhì)差異，本文采用HPLC結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法，包括聚類(lèi)分析及主成分分析，建立了一種簡(jiǎn)單、可靠的指紋圖譜方法，用于表征西洋參人參皂苷類(lèi)成分及評(píng)價(jià)不同商品規(guī)格的西洋參藥材的品質(zhì)。根據(jù)加工方法、商品規(guī)格、7種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和作為原變量進(jìn)行了相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究以藥材市場(chǎng)西洋參商品規(guī)格的劃分為依據(jù)，對(duì)西洋參藥材的化學(xué)特征與內(nèi)在質(zhì)量的相關(guān)性進(jìn)行了分析，為從外觀性狀角度制定和規(guī)范西洋參藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)提供一定的參考。

1材料

Shimadzu LC-20 AT高效液相色譜儀，Shimadzuinertsil ODS-2高效液相色譜柱C₁₈（4.6mmx250mm，5μm），Mettler-Toledo XS205 DU型電子分析天平。

人參皂苷Rg₁，（批號(hào)14052305），Re（批號(hào)14042905），Rb₁（批號(hào)14102302），Rc（批號(hào)14102805），Rb₂（批號(hào)14102804），Rb₃（批號(hào)14050407），Rd（批號(hào)14122605）對(duì)照品購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司，純度>99.0%；乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。

不同商品規(guī)格西洋參樣品共40批，購(gòu)買(mǎi)于河北省安國(guó)市藥材交易市場(chǎng)，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室鄭玉光教授鑒定為西洋參P.quinquefolius的干燥根，藥材憑證標(biāo)本保存于河北中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室。樣品詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

所采集西洋參樣品的商品規(guī)格及加工方法均依據(jù)市場(chǎng)的交易情況及《西洋參加工產(chǎn)品分等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》。進(jìn)行劃分。各產(chǎn)地單獨(dú)進(jìn)行分類(lèi)，其中長(zhǎng)度為一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，單支重為二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，加工方法為三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。而本次收集吉林產(chǎn)部分西洋參樣品出現(xiàn)發(fā)青現(xiàn)象，推測(cè)為干燥過(guò)程中加工不當(dāng)所致的青支，按照《西洋參加工產(chǎn)品分等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中的規(guī)定屬于等外品，本實(shí)驗(yàn)將其納入樣品收集范圍之內(nèi)，旨在從化學(xué)成分角度闡釋傳統(tǒng)劃分標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱Shimadzu Inertsil ODS-2 C₁₈（4.6mmx250mm，5 Ixm）；流動(dòng)相乙腈（A）水溶液（B），梯度洗脫（0～25min，22%～26%A；25～30min，26%～35%A；30～60min，35%A）；流速 mL·min^-1；檢測(cè)波長(zhǎng)203nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量10μL；理論塔板數(shù)按人參皂苷Rb₁計(jì)算應(yīng)不低于5000。對(duì)照品及樣品（S1）HPLC圖見(jiàn)圖1。

2.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)定適量人參皂苷對(duì)照品，用甲醇溶解配制人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁，Rc，Rb₂，Rb₃，Rd的對(duì)照品混合溶液，質(zhì)量濃度分別為0.238，0.524，1.450，0.172，0.106，0.102，0.200 g·L^-1。

2.3供試品溶液的制備

隨機(jī)抽取每1批西洋參樣品，粉碎并過(guò)3號(hào)篩，取樣品粉末約1g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇50mL，稱(chēng)定質(zhì)量，置水浴中加熱回流提取1.5h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用水飽和正丁醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25mL，置蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3結(jié)果

3.1西洋參7種成分含量測(cè)定

3.1.1線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5，1，2，4，8，16，20，30，50，80 μL分別注入HPLC中，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積。結(jié)果以峰面積為縱坐標(biāo)，以各單體皂苷的量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程和線性范圍，見(jiàn)表2，各成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.2精密度試驗(yàn)分別精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL，在2.1項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積為指標(biāo)計(jì)算7種成分的RSD（n=6），考察精密度。人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁，Rc，Rb₂，Rb₃，Rd的RSD分另0為1.3%，1.7%，2.1%，1.9%，2.4%，1.6%，1.1%，儀器精密度良好。

3.1.3穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一西洋參（S1）供試品溶液，分別在供試品溶液制備后第0，2，6，12，18，24 h進(jìn)樣，以3號(hào)峰為參照峰，各特征峰保留時(shí)間的RSD<3.0%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%，表明供試品溶液在制備后24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.4重復(fù)性試驗(yàn)取同一批西洋參（S1）粉末約1g，平行6份，精密稱(chēng)定，按2.3項(xiàng)下方法處理，得供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄特征圖譜，以3號(hào)峰為參照峰，各特征峰保留時(shí)間的RSD<3.0%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

3.1.5加樣回收率試驗(yàn)取已知含量（S1）的西洋參藥材樣品約1g，平行6份，精密稱(chēng)定，分別加入對(duì)照品溶液適量，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算7種成分的加樣回收率。人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁，Rc，Rb2，Rb₃，Rd的平均回收率為97.24%，99.67%，101.4%，103.8%，95.98%，98.78%，97.89%；RSD分別為2.3%，1.9%，1.2%，1.5%，2.4%，1.9%，2.1%。

3.1.6樣品的含量測(cè)定

按照2.3項(xiàng)下方法制備40批供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定40批西洋參樣品中人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁，Rc，Rb₂，Rb₃，Rd的含量，見(jiàn)表3。其中美國(guó)產(chǎn)野生西洋參人參皂苷含量最高，筆者收集的吉林產(chǎn)部分西洋參不符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，與收集的樣品發(fā)青有關(guān)，故加工不當(dāng)對(duì)藥材質(zhì)量具有一定的影響。

3.2西洋參藥材指紋圖譜研究

從西洋參藥材HPLC圖可見(jiàn)，西洋參所含成分復(fù)雜，受對(duì)照品等因素限制，前文中對(duì)人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁，Rc，Rb₂，Rb₃，Rd等7種成分進(jìn)行了含量測(cè)定。但是僅用幾種特征成分來(lái)控制藥材質(zhì)量較片面，而西洋參藥材含有數(shù)十種人參皂苷類(lèi)成分，其他未定量成分同樣對(duì)藥材質(zhì)量產(chǎn)生不同程度的影響。故本研究采用指紋圖譜進(jìn)一步對(duì)不同商品規(guī)格的西洋參質(zhì)量進(jìn)行表征和研究。

3.2.1精密度試驗(yàn)精密吸取同一西洋參（S1）供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以3號(hào)峰為參照峰，各特征峰保留時(shí)間的RSD<5.0%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%。

3.2.2穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一西洋參（S1）供試品溶液，分別在供試品溶液制備后第0，2，6，12，18，24h進(jìn)樣，以3號(hào)峰為參照峰，各特征峰保留時(shí)間的RSD<3.0%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%，表明供試品溶液在制備后24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.3重復(fù)性試驗(yàn)取同一批西洋參（S1）粉末約1g，平行6份，精密稱(chēng)定，按2.3項(xiàng)下方法處理，得供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄特征圖譜，以3號(hào)峰為參照峰，各特征峰保留時(shí)間的RSD<3.0%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

3.2.4指紋圖譜相似度分析40批西洋參樣品的色譜圖見(jiàn)圖2，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”軟件對(duì)西洋參指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，確定共有峰19個(gè)，生成對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖3。對(duì)6個(gè)不同產(chǎn)地、不同商品規(guī)格西洋參藥材指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地、不同商品規(guī)格的西洋參藥材的相似度結(jié)果在0.900以上，說(shuō)明各樣品間不具有顯著差異。

3.3結(jié)合化學(xué)計(jì)量法的不同商品規(guī)格西洋參藥材質(zhì)量對(duì)比分析

為了驗(yàn)證已建立的西洋參的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，同時(shí)進(jìn)一步說(shuō)明不同商品規(guī)格的西洋參藥材的內(nèi)在品質(zhì)差異，本研究運(yùn)用多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確保結(jié)果可靠準(zhǔn)確。

3.3.1系統(tǒng)聚類(lèi)分析運(yùn)用SPSS22.0軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)40批西洋參樣品的指紋圖譜進(jìn)行聚類(lèi)分析。其中將加工方法、規(guī)格、7種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和作為原變量，所有數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理，聚類(lèi)方法采用組間連接法及平方歐式距離法，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由系統(tǒng)分類(lèi)樹(shù)狀圖可以看出，在距離<5時(shí)，40批西洋參樣品被分為5類(lèi)，其中S9，S22，S38，S39與其他樣品差異性較大，各自成為一類(lèi)，與含量測(cè)定結(jié)果較一致，見(jiàn)表3。第一類(lèi)群與相似度分析結(jié)果具有較好的一致性。對(duì)第一類(lèi)群進(jìn)行分析可見(jiàn)，西洋參藥材按照產(chǎn)地劃分各自聚為一類(lèi)，說(shuō)明西洋參藥材品質(zhì)與市場(chǎng)劃分的藥材商品規(guī)格（如長(zhǎng)度、單支重、加工方法）并沒(méi)有相關(guān)性，而與產(chǎn)地信息相關(guān)性較大，為其主要影響因素。由聚類(lèi)分析結(jié)果推測(cè)，因受產(chǎn)區(qū)土壤、氣候等綜合因素的影響，使得西洋參中人參皂苷類(lèi)成分的某幾種成分產(chǎn)生一定的地域差異性。

3.3.2主成分分析在聚類(lèi)分析的基礎(chǔ)上，對(duì)原變量進(jìn)行主成分分析。提取3個(gè)主成分Z1，Z2，Z3，累計(jì)貢獻(xiàn)率為85.004%，其中z1貢獻(xiàn)57.182%，Z2貢獻(xiàn)14.201%，z3貢獻(xiàn)13.622%，以3個(gè)主成分建立坐標(biāo)系得到的PCA三維投影圖見(jiàn)圖5。其主成分得分分布圖的結(jié)果與聚類(lèi)分析結(jié)果相一致，即西洋參藥材的品質(zhì)與商品規(guī)格間并沒(méi)有顯著性差異，而樣品S9，S22，S38和S39單獨(dú)成類(lèi)，與其他樣品差異性較大并與含量測(cè)定結(jié)果相一致。

4討論

《西洋參加工產(chǎn)品分等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》將西洋參分為3個(gè)等級(jí)：優(yōu)等品、一等品、合格品，在此基礎(chǔ)上，按直徑、長(zhǎng)度、平均單支重劃分出長(zhǎng)支、短支、泡參、條參、參段、參須6大類(lèi)19種規(guī)格。隨著西洋參栽培技術(shù)發(fā)展、單產(chǎn)和質(zhì)量提高、分析檢測(cè)手段更新，原有的商品分級(jí)以及質(zhì)量要求均不符合市場(chǎng)要求，2005年10月14日國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)廢止了該標(biāo)準(zhǔn)。但是目前市場(chǎng)上西洋參產(chǎn)品的依然按照該標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)格進(jìn)行分類(lèi)，本實(shí)驗(yàn)研究的目的之一是結(jié)合定量化學(xué)指標(biāo)驗(yàn)證這一分類(lèi)的科學(xué)性。

本研究運(yùn)用HPLC同時(shí)測(cè)定40批西洋參藥材中7種人參皂苷類(lèi)成分，并建立了西洋參藥材的HPLC指紋圖譜。相似度分析發(fā)現(xiàn)各批次藥材之間質(zhì)量差異較小，但收集的吉林產(chǎn)部分西洋參藥材由于加工不當(dāng)導(dǎo)致其品質(zhì)下降，不符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。在此基礎(chǔ)上研究了不同產(chǎn)地、不同商品規(guī)格、不同加工方法的40批西洋參藥材的HPLC指紋圖譜，并對(duì)西洋參藥材指紋圖譜的進(jìn)行聚類(lèi)分析和主成分分析，聚類(lèi)分析結(jié)果表明西洋參藥材的品質(zhì)與傳統(tǒng)規(guī)格劃分并無(wú)相關(guān)性，而與產(chǎn)地信息特征相關(guān)性較強(qiáng)；主成分分析結(jié)果表明市售西洋參藥材的品質(zhì)較為穩(wěn)定，與傳統(tǒng)劃分的商品規(guī)格間并無(wú)顯著性差異。而樣品S9，S22，S38和S39與其他樣品具有較大的差異性，主要原因?yàn)椋篠38為美國(guó)野生品，質(zhì)量最優(yōu)；S39為各產(chǎn)區(qū)的混參須，故與其他樣品相比具有較大差異；S9人參皂苷Rd的含量與其他樣品有顯著差異；$22人參皂苷Rg₁含量較其他樣品低。但上述差異不足以證明西洋參的商品質(zhì)量與規(guī)格具有相關(guān)性。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，傳統(tǒng)的劃分方式與參商營(yíng)銷(xiāo)模式以及消費(fèi)者的購(gòu)買(mǎi)心理相符，而與藥材品質(zhì)關(guān)聯(lián)性不大。

目前市場(chǎng)銷(xiāo)售的西洋參藥材的商品規(guī)格的劃分方式使不同大小的西洋參藥材具有較好的區(qū)分度，但上述劃分標(biāo)準(zhǔn)與藥材品質(zhì)間并無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，因此亟需制定規(guī)范的西洋參藥材商品規(guī)格及等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)以約束及規(guī)范市場(chǎng)流通，確保西洋參藥材質(zhì)量。而本研究結(jié)果表明，西洋參藥材的質(zhì)量特征與產(chǎn)地具有較好的相關(guān)性，因此可以依據(jù)產(chǎn)地做為西洋參藥材規(guī)格劃分的依據(jù)，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行相關(guān)等級(jí)的制定。

本研究對(duì)40批西洋參藥材化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)采用藥典定量標(biāo)準(zhǔn)（即對(duì)人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁進(jìn)行定量）可以滿(mǎn)足西洋參藥材商品質(zhì)量?jī)?yōu)劣判斷，該結(jié)果為從西洋參藥材內(nèi)在化學(xué)成分角度制定西洋參藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)提供了參考?！盎瘜W(xué)計(jì)量法結(jié)合指紋圖譜分析”評(píng)價(jià)方法可在一定程度上表征不同產(chǎn)地藥材在化學(xué)成分方法的差別，基于二者的綜合信息，可以為西洋參的產(chǎn)地選擇，加工方法及質(zhì)量快速評(píng)價(jià)提供參考。在此基礎(chǔ)上，若能將藥效與物質(zhì)基礎(chǔ)結(jié)合起來(lái)，深入開(kāi)展譜效學(xué)研究，則更有利于闡明中藥作用機(jī)制，完善西洋參藥材的商品規(guī)格的劃分。