1株顏料紅23脫色菌的分離、鑒定及其脫色性能

張灣+孫璐璐+趙曉祥

摘要：通過濃度梯度馴化，從活性污泥中分離到1株顏料紅23高效脫色菌ZW 4，根據其形態學特征及16S rRNA基因序列分析，鑒定該好氧菌株為原壁菌（Prototheca sp.）。研究脫色菌ZW 4好氧條件、120 r/min對顏料紅23最適的脫色條件。結果表明，菌株最適宜的脫色條件為酵母粉濃度為1.0%、接種量為5%、pH值為7.5、溫度為35℃、鹽度小于2%，在此條件下，將濃度為100 mg/L的顏料紅23溶液好氧培養18 h，脫色率接近90%。對ZW4降解產物進行紫外光譜分析發現，菌株脫色機制主要為生物降解脫色；經毒性試驗表明，脫色后的顏料紅23毒性明顯降低。

關鍵詞：顏料紅23；分離；鑒定；生物脫色；毒性試驗

中圖分類號：X172；X703 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0357—05

顏料生產是精細化工生產的重要門類之一，無論是有機顏料還是無機顏料，在其生產過程中均會產生對環境造成嚴重污染的廢水。有機顏料已普遍用于油墨、涂料、橡膠制品、塑料制品、文教用品和建筑材料物的著色，還用于合成纖維原漿著色和織物染料印花，是市場覆蓋面很大的化工產品。偶氮顏料是有機顏料中品種最多、產量最大的一類，研究和解決偶氮顏料生產廢水的處理方法，可以解決大部分顏料化工廠的廢水治理問題，具有很強的代表性。偶氮顏料與偶氮染料的分子結構類似，具有相同的水質特征，而偶氮染料是染料分子中含有偶氮基（—N=N—）結構的統稱，主要污染因子為CODcr、色度、苯胺。很多偶氮顏料是以致癌芳香胺作為合成中間體的，其中色酚AS-D、AS-E、AS-OL和AS-TR作為紅色有機顏料的偶合組分，檢測時受還原劑作用使偶氮鍵斷裂，受高溫影響而導致2-羧基3-萘甲酰芳胺水解，產生鄰甲苯胺、對氯苯胺、鄰氨基苯甲醚和4-氯-2-甲基苯胺等致癌芳胺。陳榮圻列舉出一系列致癌芳胺的有機顏料，顏料紅23的分子式雖與報道中的顏料紅17僅有1個化學基團的差異，但顏料紅23尚未被列入禁用偶氮顏料的目錄中。致癌芳香胺的發現促使顏料品種研發朝環保型方向發展，但是由于高牢度、高環保型顏料制作成本較高，使不少中小型印花廠望而卻步，非環保型偶氮顏料在市場上的應用仍占主要地位。

微生物具有繁殖速度快、適應性強等特點，利用高效脫色微生物進行環境污染治理，不僅成本低，而且可減少二次污染，被認為是染料脫色和降解最經濟有效的方法。人工方法篩選對染料具有較強降解能力的高效菌，成為人們關注和研究的熱點。目前，選育和培育優良的脫色菌株或菌群是染料脫色降解的一個重要發展方向，具有重要的現實意義，已有很多關于脫色降解偶氮染料細菌、真菌、藻類等生物的報道，而對色酚類偶氮顏料微生物降解脫色的研究國內尚未見報道。由于偶氮顏料不溶于水而只能溶于有機溶劑，本試驗在篩選出對顏料紅23具有高效脫色能力菌株的基礎上，參考胡生等研究方法，選定6 mL/g二甲基亞砜為最佳有機溶劑，研究菌株對顏料紅23的脫色條件及性能，以期豐富偶氮顏料降解菌的理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 活性污泥，來源于上海市松江污水處理廠二沉池；好氧污泥，取自序批式活性污泥法（SBR）反應器，由活性污泥經10 mg/L顏料紅23廢水馴化3～4周。

1.1.4主要儀器 BXM-30R型立式壓力蒸汽高壓滅菌鍋、PYX-DHS·400-BS型隔水式熱恒溫培養箱、SPH-2102C型立式雙層搖床、VS-840-1型超凈工作臺、UV-1800PC型紫外可見分光光度計、雷磁PHS-3c型pH計、BSAl24S型電子分析天平、DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱、CT14RD型臺式高速冷凍離心機、Eclipse 80i型熒光顯微鏡。

1.2菌株分離、鑒定與菌液制備

1.2.1菌株的分離篩選 取1 mL SBR混合廢水上清液，加入到裝有100 mL富集培養基的250 mL三角瓶中，30℃恒溫振蕩培養12 h；采用相同的方法，接種1代培養液1 mL至新鮮的富集培養基中進行振蕩培養，使樣品中的好氧菌群得到富集和活化；分裝100 mL 20 mg/L含顏料的篩選培養基于250 mL錐形瓶中，接種1mL第l代活化菌液，篩選培養3～5 d；逐步增加篩選培養基中顏料的質量濃度，濃度梯度依次為20、40、60、80、100 mg/L，對混合菌液連續篩選培養5代，直至顏料紅23的最終濃度為100 mg/L；取最后1次篩選培養基中的液體1 mL按梯度稀釋，涂布于固體分離培養基平板上，30℃培養1～2 d；挑取有脫色圈且菌落明顯的菌株進行反復劃線，分離獲得純菌株；將單菌落挑取到含顏料的富集培養基中培養，不同時間段測定脫色率，選取具有最強脫色能力的菌株進行純化，保存備用。

1.2.2菌株鑒定 菌株形態特征和生理生化特性的鑒定參照《常見細菌系統鑒定手冊》進行；菌株ZW 4基因組DNA提取及測序分析委托上海基康生物技術有限公司進行，并在NCBI中與相關的16S rRNA序列進行同源性比較，采用Mega程序構建系統發育樹。

1.2.3菌液的制備 將菌株接種于100 mL富集培養基中，30℃、120 r/min搖床擴大培養；取適量菌液于無菌離心管中，6 000 r/min離心10 min；收集菌體，無菌水洗滌菌體，重復操作3次；以等體積的無菌生理鹽水重懸。

1.3測定分析方法

1.3.1菌株的生長曲線及顏料降解曲線測定 將活化后的菌液按接種量10%接種到含有100 mg/L顏料紅23的篩選培養基中，30℃、120 r/min搖床擴大培養，18 h內按10個時間點分別取樣；以液體篩選培養基為空白對照，測定菌液在波長為600 nm處的吸光度；重復3次，取平均值，得到菌株的生長曲線。同樣時間點取10 mL菌液，離心；以液體篩選培養基作為空白對照，在波長為579 nm處測定顏料紅23的剩余吸光度，計算降解率；重復3次，取平均值，得到顏料的降解曲線。

1.3.2染料脫色影響因素研究 選取營養源、營養源濃度、接種量、pH值、溫度、鹽度作為主要考察因子。在含顏料的無機鹽培養基中分別加入葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、尿素共計7種營養源，含量均為1%；加入10 mL菌液，30℃、120 r/min搖床擴大培養，一定時間后測脫色率；將試驗得到的最佳營養源添加到含顏料的無機鹽培養基中構成脫色培養基，研究其他各影響因素對顏料脫色效果的影響，僅對1個因子設置不同的影響梯度，其他最佳因素保持不變；均設置3組平行試驗。

1.3.3脫色率計算 菌株對顏料的脫色能力采用脫色率表征。取10 mL反應液，10 000 r/min離心6 min，取上清液于顏料最大吸收波長579 nm處測定吸光度D_t，以不接菌、含相同濃度顏料培養基的吸光度D。為對照，計算脫色率η，公式為：

1.3.4顏料脫色前后毒性測試 選取小麥和菜豆為試驗材料，將顆粒飽滿、大小均勻的種子放置于培養皿中，用自來水沖洗2～3次；用2%H₂O₂消毒15 min，再用自來水清洗數次，于30℃溫水中浸種吸脹30 min；培養皿內放人等直徑濾紙2張作為發芽床，每個發芽床上擺放20粒種子，光照培養箱中于25℃培養，每組3個重復，為保證種子發芽條件的適宜，必要時適當補充相應溶液以保持水分，同時將感染霉菌的種子及時用蒸餾水沖洗；培養2、4、6、7、9 d，分別調查種子的發芽率，測量胚根、胚芽長度，選擇測量數據中最有規律的1組作為有效數據。

2結果與分析

2.1菌株的分離篩選

分離得到4株對顏料紅23有脫色能力的菌株見圖2，其外形特征為：菌株ZW1的菌落呈紅色且不透明，邊緣整齊，表面光滑；菌株ZW2的菌落呈白色且不透明，圓形且較濕潤，邊緣整齊，不易挑起；菌株ZW3的菌落呈黃色且不透明，邊緣整齊，表面光滑；菌株ZW4的菌落為圓形、較小、扁平且有光澤，中央突起，邊緣整齊，表面光滑，菌落呈乳白色且不透明，易挑起。由表1可見，菌株ZW4在同一時間測得的脫色率最高。因此，后續試驗選取脫色性能最好的菌株ZW4作為目標菌株。

2.2優勢菌株ZW4革蘭氏染色及生理生化特性

由圖3可見，優勢菌株ZW4的革蘭氏染色為紫色，其為革蘭氏陽性菌。菌株ZW4經葡萄糖發酵試驗產酸不產氣，經乙酞甲基甲醇、明膠液化、吲哚、尿素水解試驗檢測均為陰性，經苯丙氨酸脫氫酶、淀粉水解酶、過氧化氫酶試驗檢測均為陽性，經甲基紅試驗檢測陰性、陽性均有。

2.3菌株的16S rRNA序列分析

由圖4可見，菌株ZW4與Prototheca sp.的相似度最高，達到89.7%，而低于一般相似度的97.5%，為疑似新種，將菌株ZW4命名為原壁菌（Prototheca sp.）。

2.4菌株的生長曲線及顏料紅23的脫色曲線

由圖5可見，度過前4 h的適應期，菌體開始在培養基中快速生長，顏料的脫色與菌體生長同步；好氧培養8 h，菌體的D_600nm約達到0.59，此時顏料紅23的脫色率達到70%以上；培養18 h，菌體對顏料紅23的脫色率達到91.6%。結果說明菌株ZW4在含有顏料的培養基中能良好生長，且可對顏料紅23進行有效脫色，是1株好氧條件下對顏料脫色能力較強的菌株。

2.5營養源對菌株ZW4脫色性能的影響

在沒有外加營養源的情況下，菌株無法生長，菌株不能以顏料紅23作為唯一碳源進行代謝。由圖6可見，不同的營養源對菌株ZW4的脫色效果各異；脫色效果最好的2種營養源分別是酵母粉、蛋白胨，18 h脫色率分別可達到91.9%、88.1%，可能是由于這2種營養源均是復雜的有機含氮化合物，既能提供碳源又能提供氮源；無機氮源尿素作為營養源時，菌株的脫色效果很低，只有34%左右；牛肉膏、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉這4種營養源，也有較好的脫色效果。在后續的試驗中，選取酵母粉作為顏料脫色菌株ZW4生長的營養源。

2.6酵母粉濃度對菌株ZW4脫色效果的影響

在含顏料的好氧培養基中設置0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%、1.5%、2.0%共7個酵母粉濃度。由圖7可見，顏料脫色率隨酵母粉濃度升高先呈增加趨勢，酵母粉濃度從0.1%增大到1.0%時，菌株培養18 h對染料的脫色率從58.9%增至90.9%；酵母粉濃度從1.0%增至2.0%時，顏料脫色率沒有明顯差異，約為90%。利用微生物處理染料廢水，過多的外加營養源會增加水體的COD及氨氮，造成水體二次污染，因此在對脫色率影響不大的情況下，應選擇低濃度的營養源，故菌株脫色顏料的最適酵母粉濃度為1.0%。

2.7接種量對菌株ZW4脫色效果的影響

在顏料脫色培養基中設置1%、2%、3%、4%、5%、6%、8%、10%、12%共9個接種量。由圖8可見，菌株ZW4接種量為5%時，脫色率達到87.8%；接種量從5%增至10%時，脫色率有所升高，但升幅并不大；接種量繼續增大，脫色率反而有所下降，可能是由于過大的接種量導致細菌之間發生營養、空間競爭性抑制作用；而接種量小于3%時，可能由于菌量較少，菌體生長較慢，脫色率低于70%。從成本和微生物生長繁殖等角度考慮，確定5%接種量為最適接種量。

2.8溫度對菌株ZW4脫色效果的影響

設置10、15、20、25、30、35、40、45、50℃共9個溫度梯度考察溫度對脫色效果的影響。由圖9可見，10、50℃時，菌株ZW4的脫色效果相對較差，18 h時脫色率分別為56.3%、56.5%，此時菌液D_600nm很低，這說明過低或過高的溫度抑制了菌株生長，從而降低了菌株的脫色性能；菌株在20～35℃范圍內具有較好的脫色能力，18 h時脫色率達到85%左右；脫色最佳溫度為35℃，脫色率最高，可達到87.3%。這是由于隨著溫度的升高，偶氮染料的酶促反應速率和菌體的生長速率加快，導致脫色效果提升，當溫度增長過高，可能會引起菌體的重要組成成分如蛋白質、核酸和酶等對溫度敏感的物質發生不同程度破壞，從而影響菌株的脫色能力。因此，選擇35℃為試驗最合適的溫度。

2.9 pH值對菌株ZW4脫色效果的影響

pH值是菌株生長和偶氮染料降解的一個重要參數，通過影響細胞質膜的通透性和結構來影響菌株的生長速率，對酶活性也有一定影響，一般偶氮染料脫色合適的pH值范圍在6.0～10.0之間，本試驗將脫色培養基的pH值調為3.5、4.5、5.5、6.5、7.0、7.5、8.5、9.5共8個梯度。由圖10可見，pH值為3.5、4.5時，顏料的脫色率低于70%，此時菌株的D_600nm分別只有0.254、O.347，這說明過酸條件下，菌株生長受到抑制，從而影響脫色效果；pH值在5.5～9.5范圍，菌株均有很好的脫色能力，其中以pH值為7.5時脫色率最高，菌株培養18 h對顏料的脫色率達到88.5%。

2.10鹽度對菌株ZW4脫色效果的影響

在酵母粉1.0%、接種量5%、溫度35℃、pH值為7.5條件下，設置10個鹽度梯度以研究鹽度對菌株顏料脫色性能的影響。由圖11可見，鹽度小于2.0%時，染料的脫色率約為90%，低濃度的鹽溶液對菌株脫色能力沒有明顯影響，鹽度為0%、0.5%、1.0%、2.0%時菌體D_600nm分別為1.233、1.240、1.234、1.212；鹽度為2.0%～15.0%，顏料的脫色率不斷降低，菌株活性隨鹽度升高受到抑制，鹽度高達10%、12%、15%時，48 h時菌株的脫色率分別僅為66.5%、58.2%、49.1%，此時菌體濃度很低。因此，鹽度應小于2%。

2.11顏料初始濃度對菌株ZW4脫色的影響

設置50、100、150、200、300、400、500 mg/L共7個顏料濃度梯度，以研究顏料初始濃度對菌株脫色性能的影響。由圖12可見，隨著顏料起始濃度的增加，相同時間段內，菌株的脫色率逐漸降低；顏料起始濃度為50、100、150 mg/L時，菌株的脫色率達到90%所需的時間分別為18、24、42 h。菌株的脫色率隨顏料濃度的升高而降低，這可能是因為高濃度顏料對菌株有毒副作用，從而抑制菌株對顏料紅23的脫色。

2.12顏料生物的脫色方式

微生物對偶氮染料的脫色機理一般可分為2大類，即吸附脫色和降解脫色。對脫色48 h的上清液進行200～700 nm紫外光譜掃描發現，隨著反應的不斷進行，染料特征吸收波長579 nm處的特征吸收明顯降低，這說明菌株Proto-theca sp.能較為徹底地降解顏料紅23；降解后菌液在388 nm左右處有新的吸收峰生成，這說明有新的物質產生，顏料的生物脫色方式主要是降解脫色（圖13）。

2.13菌株脫色顏料紅23前后的毒性試驗

通過比較2、4、6、7、9 d這5 d的數據，發現9 d的數據有較好的規律。由表2可見，顏料紅23脫色前后處理的小麥、菜豆種子，其生長情況有明顯差異；與對照相比，顏料紅23脫色前的溶液明顯抑制小麥、菜豆種子胚芽和胚根的生長；經菌株ZW4脫色后的顏料溶液處理種子，其生長雖不及對照，但較脫色前已有明顯改善，這可以說明顏料紅23經菌株脫色后的毒性有明顯降低。

3結論與討論

Kodam等在好氧條件下，篩選出能快速生長、脫色范圍廣且對染料降解徹底的好氧細菌。。目前，國內外尚未有顏料生物脫色方式的報道，能以降解物質為唯一碳源的報道也很少。本試驗發現的菌株ZW4不能以顏料紅23作為唯一碳源生存；通過紫外-可見分光光度計測定發現，脫色后的顏料紅23廢水生成新的物質，至于是何種物質還有待進一步研究。偶氮染料生物處理技術作為一種經濟、環境友好型的方法，在處理工業廢水、印染廢水方面已得到廣泛應用，但受到環境污染影響，實際應用降解菌時常會發生降解菌總量減少、從自然界篩選到的降解菌降解酶活性普遍較低等問題。謝學輝等認為，混合菌群往往對試驗廢水具有更好的脫色率。本試驗篩選出4株具有較好脫色能力的菌株，僅對優勢菌株ZW4對顏料紅23廢水的脫色能力進行研究，后續可以考慮選擇最佳的混合菌群以進行顏料廢水脫色研究。

總之，通過本試驗獲得結論主要有：從活性污泥中篩選出1株能高效脫色顏料紅23的菌株ZW4，經16S rRNA基因序列鑒定，該菌株與其他菌株同源性不高，有可能為1個新的菌種，結合菌株形態學特征，暫將該菌株命名為原壁菌（Prototh-eca sp.）；菌株ZW4脫色顏料的最佳營養源是酵母粉，最適宜條件為酵母粉濃度1.0%、接種量5%、pH值7.5、溫度35℃，菌株耐鹽性能良好，在高達8%鹽濃度下對顏料有較好的脫色效果；紫外-可見分光光度計掃描脫色代謝產物的吸收圖譜發現，菌株ZW4對顏料脫色過程主要以生物降解為主；毒性試驗表明，脫色后的顏料紅23對植物的毒性下降。